本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞核內(nèi)m~6A讀碼器YTHDC1調(diào)控mRNA選擇性剪切機(jī)制研究　出處：《中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：在至今被發(fā)現(xiàn)的mRNA化學(xué)修飾中,6-甲基腺嘌呤(m6A)是最普遍存在的一種核苷酸甲基化修飾形式。前期的研究發(fā)現(xiàn),在哺乳動(dòng)物中的平均每條mRNA上存在3-5個(gè)m6A修飾,并且它的結(jié)合基序?yàn)镽EACH(R=G or A, H=A, C or U)。m6A甲基化修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過(guò)程,它的甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中三個(gè)重要組分已被報(bào)道,它們分別是METTL3、METTL14和WTAP。在這3個(gè)組分中,METTL3與METTL14作為甲基化轉(zhuǎn)移酶的催化亞基而WTAP作為調(diào)節(jié)亞基。m6A去甲基化酶目前發(fā)現(xiàn)的有兩種,分別是ALKBH5和FTO。ALKBH5被報(bào)道與精子發(fā)育有關(guān),而FTO首先在并指突變體小鼠中被發(fā)現(xiàn),隨后證明它跟人的肥胖和糖脂代謝有關(guān)。m6A去甲基化酶和甲基化轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)極大的推動(dòng)了m6A的相關(guān)研究。目前發(fā)現(xiàn)的m6A讀碼器有定位在細(xì)胞質(zhì)的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3,以及定位在細(xì)胞核的YTHDC1。細(xì)胞質(zhì)m6A讀碼器YTHDF2和YTHDF 1分別被報(bào)道參與mRNA的降解和翻譯。然而,對(duì)m6A細(xì)胞核讀碼器YTHDC1的研究卻知之甚少。YTHDC1被報(bào)道定位在YT小體上,而YT小體與核小斑是毗連的,我們推測(cè)YTHDC1可能與核小斑內(nèi)RNA加工蛋白相互作用從而影響RNA剪接過(guò)程。為了驗(yàn)證我們的假設(shè),我們結(jié)合免疫共沉淀技術(shù)和二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)了5個(gè)與YTHDC1相互作用的SR家族蛋白SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、SRSF10。通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上的剪接分析,我們發(fā)現(xiàn)YTHDC1、SRSF3以及METTL3能促進(jìn)外顯子保留而SRSF10則促進(jìn)外顯子剪接。為了探究YTHDC1和SR家族蛋白靶向外顯子的剪接模式,結(jié)合光活性增強(qiáng)的核糖核苷交聯(lián)和免疫共沉淀測(cè)序(PAR-CLIP-seq)以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)數(shù)據(jù),我們分析發(fā)現(xiàn)YTHDC1和SRSF3促進(jìn)它們靶向外顯子的保留而SRSF10則促進(jìn)它靶向外顯子的切除,而其它SR蛋白并沒(méi)有顯著的偏好性。隨后,我們從分析數(shù)據(jù)中隨機(jī)挑選2個(gè)基因的RT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了YTHDC1、SRSF3與SRSF10靶向外顯子的剪接變化。通過(guò)對(duì)YTHDC1、SRSF3和SRSF10的結(jié)合位點(diǎn)平均距離的分析,我們發(fā)現(xiàn)SRSF3在mRNA上的結(jié)合位點(diǎn)與YTHDC1在其上結(jié)合位點(diǎn)的平均距離比SRSF10更近。通過(guò)免疫共沉降技術(shù),我們分別在體內(nèi)和體外證明了YTHDC1與SRSF3和SRSF10具有直接相互作用,并且SRSF3能與SRSF10競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合YTHDC1。它們競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合YTHDC1進(jìn)一步印證了SRSF3和SRSF10相反的剪接模式。我們猜測(cè)SRSF3與SRSF10對(duì)共同靶向外顯子相反的剪接模式可能是因?yàn)樗鼈儗?duì)RNA的結(jié)合強(qiáng)弱變化導(dǎo)致的。通過(guò)PAR-CLIP技術(shù)結(jié)合3’末端生物素標(biāo)記實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲低YTHDC1后,SRSF3對(duì)RNA的結(jié)合信號(hào)減弱而SRSF10對(duì)RNA的結(jié)合信號(hào)增強(qiáng)。這說(shuō)明YTHDC1能招募SRSF3同時(shí)抑制SRSF10結(jié)合在RNA上,從而導(dǎo)致剪接形式的改變。通過(guò)外源回補(bǔ)實(shí)驗(yàn),我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)野生型的YTHDC1能夠回補(bǔ)因敲低YTHDC1引起的SRSF3和SRSF10對(duì)RNA的結(jié)合能力以及選擇性剪接紊亂,但是m6A結(jié)合關(guān)鍵氨基酸突變的YTHDC1則不能回補(bǔ)。這說(shuō)明YTHDC1介導(dǎo)的剪接變化是m6A依賴的。通過(guò)對(duì)內(nèi)源YTHDC1、SRSF3和SRSF10的蛋白含量進(jìn)行檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)SRSF3在體內(nèi)的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SRSF10,所以很有可能在正常的生理狀態(tài)下,SRSF3結(jié)合大部分的YTHDC1導(dǎo)致它們靶向外顯子保留水平占主導(dǎo)。我們的研究為細(xì)胞核內(nèi)m6A讀碼器YTHDC1影響前體mRNA剪接因子與mRNA結(jié)合的選擇性剪接調(diào)控的機(jī)制提供了直接有力的證據(jù)。同時(shí)為進(jìn)一步研究m6A的生物功能和RNA表觀遺傳提供依據(jù),也為正常生理(如干細(xì)胞干性維持和分化)或異常病理生命活動(dòng)(如惡性腫瘤等)關(guān)聯(lián)分子機(jī)理提供新的研究方向。
[Abstract]:6 - methyladenine ( m6A ) is the most ubiquitous form of nucleotide methylation modification in the mRNA chemistry found to date . Previous studies have found that there are 3 - 5 m6A modifications on the average of each mRNA in mammals , and that its binding motif is either ( R = G or A , H = A , C or U ) . In order to clarify our hypothesis , we found that there are two types of SRSF10 , SRSF3 , SRSF7 , SRSF9 and SRSF10 , which are located in cytoplasm .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1359906