本文關鍵詞：細胞核內(nèi)m~6A讀碼器YTHDC1調(diào)控mRNA選擇性剪切機制研究　出處：《中國科學院北京基因組研究所》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：在至今被發(fā)現(xiàn)的mRNA化學修飾中,6-甲基腺嘌呤(m6A)是最普遍存在的一種核苷酸甲基化修飾形式。前期的研究發(fā)現(xiàn),在哺乳動物中的平均每條mRNA上存在3-5個m6A修飾,并且它的結(jié)合基序為REACH(R=G or A, H=A, C or U)。m6A甲基化修飾是一個動態(tài)可逆的過程,它的甲基化轉(zhuǎn)移酶復合物中三個重要組分已被報道,它們分別是METTL3、METTL14和WTAP。在這3個組分中,METTL3與METTL14作為甲基化轉(zhuǎn)移酶的催化亞基而WTAP作為調(diào)節(jié)亞基。m6A去甲基化酶目前發(fā)現(xiàn)的有兩種,分別是ALKBH5和FTO。ALKBH5被報道與精子發(fā)育有關,而FTO首先在并指突變體小鼠中被發(fā)現(xiàn),隨后證明它跟人的肥胖和糖脂代謝有關。m6A去甲基化酶和甲基化轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)極大的推動了m6A的相關研究。目前發(fā)現(xiàn)的m6A讀碼器有定位在細胞質(zhì)的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3,以及定位在細胞核的YTHDC1。細胞質(zhì)m6A讀碼器YTHDF2和YTHDF 1分別被報道參與mRNA的降解和翻譯。然而,對m6A細胞核讀碼器YTHDC1的研究卻知之甚少。YTHDC1被報道定位在YT小體上,而YT小體與核小斑是毗連的,我們推測YTHDC1可能與核小斑內(nèi)RNA加工蛋白相互作用從而影響RNA剪接過程。為了驗證我們的假設,我們結(jié)合免疫共沉淀技術和二級串聯(lián)質(zhì)譜技術發(fā)現(xiàn)了5個與YTHDC1相互作用的SR家族蛋白SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、SRSF10。通過在轉(zhuǎn)錄水平上的剪接分析,我們發(fā)現(xiàn)YTHDC1、SRSF3以及METTL3能促進外顯子保留而SRSF10則促進外顯子剪接。為了探究YTHDC1和SR家族蛋白靶向外顯子的剪接模式,結(jié)合光活性增強的核糖核苷交聯(lián)和免疫共沉淀測序(PAR-CLIP-seq)以及轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)數(shù)據(jù),我們分析發(fā)現(xiàn)YTHDC1和SRSF3促進它們靶向外顯子的保留而SRSF10則促進它靶向外顯子的切除,而其它SR蛋白并沒有顯著的偏好性。隨后,我們從分析數(shù)據(jù)中隨機挑選2個基因的RT-PCR實驗進一步證實了YTHDC1、SRSF3與SRSF10靶向外顯子的剪接變化。通過對YTHDC1、SRSF3和SRSF10的結(jié)合位點平均距離的分析,我們發(fā)現(xiàn)SRSF3在mRNA上的結(jié)合位點與YTHDC1在其上結(jié)合位點的平均距離比SRSF10更近。通過免疫共沉降技術,我們分別在體內(nèi)和體外證明了YTHDC1與SRSF3和SRSF10具有直接相互作用,并且SRSF3能與SRSF10競爭性的結(jié)合YTHDC1。它們競爭性的結(jié)合YTHDC1進一步印證了SRSF3和SRSF10相反的剪接模式。我們猜測SRSF3與SRSF10對共同靶向外顯子相反的剪接模式可能是因為它們對RNA的結(jié)合強弱變化導致的。通過PAR-CLIP技術結(jié)合3’末端生物素標記實驗,我們發(fā)現(xiàn)當敲低YTHDC1后,SRSF3對RNA的結(jié)合信號減弱而SRSF10對RNA的結(jié)合信號增強。這說明YTHDC1能招募SRSF3同時抑制SRSF10結(jié)合在RNA上,從而導致剪接形式的改變。通過外源回補實驗,我們進一步發(fā)現(xiàn)野生型的YTHDC1能夠回補因敲低YTHDC1引起的SRSF3和SRSF10對RNA的結(jié)合能力以及選擇性剪接紊亂,但是m6A結(jié)合關鍵氨基酸突變的YTHDC1則不能回補。這說明YTHDC1介導的剪接變化是m6A依賴的。通過對內(nèi)源YTHDC1、SRSF3和SRSF10的蛋白含量進行檢測,我們發(fā)現(xiàn)SRSF3在體內(nèi)的含量遠遠高于SRSF10,所以很有可能在正常的生理狀態(tài)下,SRSF3結(jié)合大部分的YTHDC1導致它們靶向外顯子保留水平占主導。我們的研究為細胞核內(nèi)m6A讀碼器YTHDC1影響前體mRNA剪接因子與mRNA結(jié)合的選擇性剪接調(diào)控的機制提供了直接有力的證據(jù)。同時為進一步研究m6A的生物功能和RNA表觀遺傳提供依據(jù),也為正常生理(如干細胞干性維持和分化)或異常病理生命活動(如惡性腫瘤等)關聯(lián)分子機理提供新的研究方向。
[Abstract]:6 - methyladenine ( m6A ) is the most ubiquitous form of nucleotide methylation modification in the mRNA chemistry found to date . Previous studies have found that there are 3 - 5 m6A modifications on the average of each mRNA in mammals , and that its binding motif is either ( R = G or A , H = A , C or U ) . In order to clarify our hypothesis , we found that there are two types of SRSF10 , SRSF3 , SRSF7 , SRSF9 and SRSF10 , which are located in cytoplasm .

【學位授予單位】：中國科學院北京基因組研究所
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78

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本文編號：1359906