本文關鍵詞：雙光子紅光細胞器和RNA探針的合成及其在活細胞高保真熒光成像中的應用　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：在生物熒光成像中,高保真度的熒光圖像有助于研究者們獲取關于靶標的準確信息,并有效地觀察它們的變化。要想提高圖像的保真度,提高探針的信噪比是一種很有效的方法。針對細胞膜或細胞內(nèi)具有膜結構的細胞器,要想設計一個高信噪比的探針,粘度敏感型的分子轉(zhuǎn)子是一種很好的選擇。在非粘性或者低粘性的環(huán)境中,分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)較快,這種旋轉(zhuǎn)消耗了分子的激發(fā)態(tài)能量,導致強烈的熒光淬滅;當分子轉(zhuǎn)子處于高粘度環(huán)境中,分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限,降低了非輻射躍遷的可能性,則熒光恢復。而膜結構恰好可以提供一個高粘度環(huán)境。所以,只有當探針靶向膜時才能發(fā)光,未到膜上的探針則不發(fā)光。這樣膜外分子的背景熒光大大降低,其信噪比大大提高。另外,通過設計得到具有雙光子性質(zhì)的紅光發(fā)射的分子也是提高熒光探針信噪比的有效方法。在成像時,紅光發(fā)射可以避免在藍光/綠光區(qū)域細胞內(nèi)的自發(fā)熒光,能夠使背景噪音減到最小,從而提高探針的信噪比。在雙光子激發(fā)下,盡管生物內(nèi)源性熒光物質(zhì)也會發(fā)出熒光,但是由于這些物質(zhì)的雙光子吸收截面值比較小,它們的熒光往往比較弱。因此,如果一個探針的雙光子吸收截面值遠遠大于這些內(nèi)源性熒光物質(zhì)的,那么這個探針在利用雙光子熒光顯微鏡時就可以給出一個高的信噪比。遺憾的是單光子激發(fā)和雙光子激發(fā)遵循不同的選律,傳統(tǒng)的單光子探針的雙光子吸收截面太小以至于不能用于雙光子熒光顯微鏡。針對這一現(xiàn)狀,本論文主要設計合成具有轉(zhuǎn)子性質(zhì)的雙光子紅光探針用于高保真成像細胞器和RNA。首先,設計合成了雙光子紅光線粒體探針�；罴毎麅�(nèi)線粒體形態(tài)和數(shù)量時時刻刻都在變化,這種變化與各種損傷或者疾病息息相關,高保真度的熒光圖像可以讓人們有效地觀察到它們的變化。但是目前雙光子紅光線粒體探針報道較少,且成像效果不是很好。在第二章中,本論文設計合成了 4種雙光子陽離子鹽化合物BCVPⅠ,BCVTⅠ,BCVⅡ和HJVPⅠ。其中改造經(jīng)典轉(zhuǎn)子DCVJ得到的HJVPⅠ比咔唑衍生物BCVPⅠ,BCVTⅠ和BCVⅡ轉(zhuǎn)子性能要好,而且熒光發(fā)射相對來說較紅。作為一個分子轉(zhuǎn)子,HJVPⅠ在低粘度溶劑中單雙光子熒光很低,而在高粘度甘油中單雙光子熒光很強。高信噪比的HJVPⅠ可以在永生化細胞和正常細胞中高保真成像線粒體。HJVPⅠ與S-11348雙染實驗說明HJYPⅠ可以染色活細胞中的線粒體。另外,HJVPⅠ具有好的細胞膜通透性、低的毒性、好的光穩(wěn)定性、大的斯克托斯位移以及與Hoechst 33342良好的兼容性等優(yōu)點。這些良好的性能使得HJYPⅠ成為一個具有高信噪比的雙光子紅光線粒體探針。其次,設計合成了免洗型雙光子紅光細胞膜探針。細胞膜作為細胞的屏障在生物系統(tǒng)中起著至關重要的角色。它不僅可以通過選擇性透過某些物質(zhì)來保護細胞的完整性,而且與信號轉(zhuǎn)導、細胞分化、細胞融合以及其他生物活性息息相關。對于活細胞,細胞在受到外界刺激時其形態(tài)會隨之改變,而細胞膜的輪廓正是細胞形態(tài)的體現(xiàn)。輕微的刺激可能會引起細胞的形態(tài)甚至是生理變化,如洗滌。洗滌可以改變細胞內(nèi)的環(huán)境,影響活細胞的生理和結構完整性,就算洗滌也不能把未和靶標結合的探針全部洗出。另外,雖然現(xiàn)代醫(yī)學比較發(fā)達,但是有些疾病人們還只是停留在研究階段。這就需要冰凍組織(可長時間保存)來研究,在研究的過程中如果有特定的探針標出細胞膜,即標出細胞的邊緣,這樣有利研究者定位研究。但是目前標記固定細胞或組織中細胞膜的探針甚是缺乏。在第三章中,本論文設計合成了 4種雙光子化合物BCVOPⅠ,BCVOⅡ,ASOPⅠ-1和HQVOPⅠ�；诮�(jīng)典轉(zhuǎn)子的紅光ASOPⅠ-1和HQVOPⅠ不但保持著轉(zhuǎn)子性質(zhì),而且具有雙光子性能,可以直接標記活細胞、固定細胞和組織中的細胞膜,染色過程可以免洗。再次,設計合成了免洗型雙光子紅光RNA探針。RNA作為生物細胞的遺傳信息中間載體,不但參與蛋白質(zhì)的合成,還參與基因表達調(diào)控。RNA對生物體的重要性不言而喻。與前面提到的線粒體和細胞膜探針相比,基于小分子的RNA探針報道的非常少,更不用說雙光子紅光的RNA探針了。目前合成RNA探針的難點是:(1)與核酸結合的小分子更易結合DNA;(2)細胞中的蛋白質(zhì)和膜干擾RNA探針的結合專一性;(3)結合機理不清楚。目前報道的共18種RNA探針,其中有3種探針只能在死細胞中成像RNA,而其他15種探針雖然能在活細胞中成像RNA,但是有些探針孵育時間長達12 h。在這些報道的探針中,所有探針在染色后都需要洗滌步驟。我們知道對于細胞來說,輕微的刺激可能會引起細胞的形態(tài)甚至是生理變化,如洗滌。所以,在第四章中本論文設計合成了一種免洗型的RNA探針。具有良好轉(zhuǎn)子性質(zhì)的MOBTⅠ通過簡單孵育20 min就可以進入SiHa,HeLa和BMSC細胞中,無須洗滌可直接到共焦顯微鏡和雙光子熒光顯微鏡上觀察3種細胞內(nèi)的RNA。無論是收集綠光還是紅光,都可以清楚的看到細胞內(nèi)RNA的分布情況。而且MOBTⅠ無論是在單光子成像還是雙光子成像是都比商業(yè)化的探針SYTO RNA-Select表現(xiàn)出強的耐光性。最后,設計合成了探測線粒體膜電位的免洗型雙光子紅光探針。線粒體膜電位(MMP)是代表線粒體功能的一個很重要的參數(shù)。它的降低意味著線粒體電子運輸鏈的破壞,這會導致細胞的功能紊亂甚至是死亡。因此,MMP不同狀態(tài)的反饋,如正常、降低和消失,對于生物醫(yī)學研究和相關疾病的診斷尤其有用。到目前為止,主要有兩種探針:(1)熒光強度探針(例如羅丹明123,TMRE和TMRM),但是這些探針僅用熒光成像很難區(qū)分MMP降低或者消失。(2)熒光比色探針(例如JC-1),在每次實驗之前JC-1的染色濃度需要重復調(diào)試,當用低濃度染色時,很難形成J聚集;而高濃度由于水溶性較差又會形成塊狀沉淀,這將為測試帶來極大的不便。正如前幾章介紹的一樣,洗滌會影響細胞的狀態(tài),甚至是生理特征,這樣會影響MMP,給測試結果帶來一定的誤差。在第五章中,本論文設計合成了兩個雙光子紅光陽離子鹽化合物HMOBTⅠ和ASHTⅠ。兩種化合物具有良好的轉(zhuǎn)子特性,在染色細胞的時候可以免洗。當MMP變化時,HMOBTⅠ和ASHTⅠ可以從線粒體分別靶向RNA或者核酸(NA)。這樣通過細胞內(nèi)的熒光位置變化可以輕易地看到MMP的變化。具有轉(zhuǎn)子特性的兩種化合物在染色細胞時無需洗滌,可以給出MMP變化的準確信息。綜上,本論文設計合成了一些雙光子紅光探針用來高保真成像細胞器及RNA�；谵D(zhuǎn)子的這些探針在染色細胞的時候可以免洗,不但減少了對細胞的傷害,而且可以給出靶標的準確信息,尤其是像線粒體和細胞膜這種形態(tài)時時刻刻都在變化的細胞器。這為實現(xiàn)線粒體探針,細胞膜探針以及RNA探針商業(yè)化奠定了基礎。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q2-33;O657.3

【參考文獻】

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1 ;Carbazole tricationic salt:A novel potential two-photon fluorescent DNA probe for nucleic imaging of cells[J];Chinese Science Bulletin;2010年32期

2 于曉強;陶緒堂;蔣民華;;雙光子生物熒光顯微技術中的探針問題[J];大學化學;2008年01期

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本文編號：1348856