本文關(guān)鍵詞：雙光子紅光細(xì)胞器和RNA探針的合成及其在活細(xì)胞高保真熒光成像中的應(yīng)用　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：在生物熒光成像中,高保真度的熒光圖像有助于研究者們獲取關(guān)于靶標(biāo)的準(zhǔn)確信息,并有效地觀察它們的變化。要想提高圖像的保真度,提高探針的信噪比是一種很有效的方法。針對(duì)細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)具有膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器,要想設(shè)計(jì)一個(gè)高信噪比的探針,粘度敏感型的分子轉(zhuǎn)子是一種很好的選擇。在非粘性或者低粘性的環(huán)境中,分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)較快,這種旋轉(zhuǎn)消耗了分子的激發(fā)態(tài)能量,導(dǎo)致強(qiáng)烈的熒光淬滅;當(dāng)分子轉(zhuǎn)子處于高粘度環(huán)境中,分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限,降低了非輻射躍遷的可能性,則熒光恢復(fù)。而膜結(jié)構(gòu)恰好可以提供一個(gè)高粘度環(huán)境。所以,只有當(dāng)探針靶向膜時(shí)才能發(fā)光,未到膜上的探針則不發(fā)光。這樣膜外分子的背景熒光大大降低,其信噪比大大提高。另外,通過設(shè)計(jì)得到具有雙光子性質(zhì)的紅光發(fā)射的分子也是提高熒光探針信噪比的有效方法。在成像時(shí),紅光發(fā)射可以避免在藍(lán)光/綠光區(qū)域細(xì)胞內(nèi)的自發(fā)熒光,能夠使背景噪音減到最小,從而提高探針的信噪比。在雙光子激發(fā)下,盡管生物內(nèi)源性熒光物質(zhì)也會(huì)發(fā)出熒光,但是由于這些物質(zhì)的雙光子吸收截面值比較小,它們的熒光往往比較弱。因此,如果一個(gè)探針的雙光子吸收截面值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于這些內(nèi)源性熒光物質(zhì)的,那么這個(gè)探針在利用雙光子熒光顯微鏡時(shí)就可以給出一個(gè)高的信噪比。遺憾的是單光子激發(fā)和雙光子激發(fā)遵循不同的選律,傳統(tǒng)的單光子探針的雙光子吸收截面太小以至于不能用于雙光子熒光顯微鏡。針對(duì)這一現(xiàn)狀,本論文主要設(shè)計(jì)合成具有轉(zhuǎn)子性質(zhì)的雙光子紅光探針用于高保真成像細(xì)胞器和RNA。首先,設(shè)計(jì)合成了雙光子紅光線粒體探針�；罴�(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)和數(shù)量時(shí)時(shí)刻刻都在變化,這種變化與各種損傷或者疾病息息相關(guān),高保真度的熒光圖像可以讓人們有效地觀察到它們的變化。但是目前雙光子紅光線粒體探針報(bào)道較少,且成像效果不是很好。在第二章中,本論文設(shè)計(jì)合成了 4種雙光子陽離子鹽化合物BCVPⅠ,BCVTⅠ,BCVⅡ和HJVPⅠ。其中改造經(jīng)典轉(zhuǎn)子DCVJ得到的HJVPⅠ比咔唑衍生物BCVPⅠ,BCVTⅠ和BCVⅡ轉(zhuǎn)子性能要好,而且熒光發(fā)射相對(duì)來說較紅。作為一個(gè)分子轉(zhuǎn)子,HJVPⅠ在低粘度溶劑中單雙光子熒光很低,而在高粘度甘油中單雙光子熒光很強(qiáng)。高信噪比的HJVPⅠ可以在永生化細(xì)胞和正常細(xì)胞中高保真成像線粒體。HJVPⅠ與S-11348雙染實(shí)驗(yàn)說明HJYPⅠ可以染色活細(xì)胞中的線粒體。另外,HJVPⅠ具有好的細(xì)胞膜通透性、低的毒性、好的光穩(wěn)定性、大的斯克托斯位移以及與Hoechst 33342良好的兼容性等優(yōu)點(diǎn)。這些良好的性能使得HJYPⅠ成為一個(gè)具有高信噪比的雙光子紅光線粒體探針。其次,設(shè)計(jì)合成了免洗型雙光子紅光細(xì)胞膜探針。細(xì)胞膜作為細(xì)胞的屏障在生物系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的角色。它不僅可以通過選擇性透過某些物質(zhì)來保護(hù)細(xì)胞的完整性,而且與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞融合以及其他生物活性息息相關(guān)。對(duì)于活細(xì)胞,細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)其形態(tài)會(huì)隨之改變,而細(xì)胞膜的輪廓正是細(xì)胞形態(tài)的體現(xiàn)。輕微的刺激可能會(huì)引起細(xì)胞的形態(tài)甚至是生理變化,如洗滌。洗滌可以改變細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境,影響活細(xì)胞的生理和結(jié)構(gòu)完整性,就算洗滌也不能把未和靶標(biāo)結(jié)合的探針全部洗出。另外,雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)比較發(fā)達(dá),但是有些疾病人們還只是停留在研究階段。這就需要冰凍組織(可長(zhǎng)時(shí)間保存)來研究,在研究的過程中如果有特定的探針標(biāo)出細(xì)胞膜,即標(biāo)出細(xì)胞的邊緣,這樣有利研究者定位研究。但是目前標(biāo)記固定細(xì)胞或組織中細(xì)胞膜的探針甚是缺乏。在第三章中,本論文設(shè)計(jì)合成了 4種雙光子化合物BCVOPⅠ,BCVOⅡ,ASOPⅠ-1和HQVOPⅠ�；诮�(jīng)典轉(zhuǎn)子的紅光ASOPⅠ-1和HQVOPⅠ不但保持著轉(zhuǎn)子性質(zhì),而且具有雙光子性能,可以直接標(biāo)記活細(xì)胞、固定細(xì)胞和組織中的細(xì)胞膜,染色過程可以免洗。再次,設(shè)計(jì)合成了免洗型雙光子紅光RNA探針。RNA作為生物細(xì)胞的遺傳信息中間載體,不但參與蛋白質(zhì)的合成,還參與基因表達(dá)調(diào)控。RNA對(duì)生物體的重要性不言而喻。與前面提到的線粒體和細(xì)胞膜探針相比,基于小分子的RNA探針報(bào)道的非常少,更不用說雙光子紅光的RNA探針了。目前合成RNA探針的難點(diǎn)是:(1)與核酸結(jié)合的小分子更易結(jié)合DNA;(2)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和膜干擾RNA探針的結(jié)合專一性;(3)結(jié)合機(jī)理不清楚。目前報(bào)道的共18種RNA探針,其中有3種探針只能在死細(xì)胞中成像RNA,而其他15種探針雖然能在活細(xì)胞中成像RNA,但是有些探針孵育時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12 h。在這些報(bào)道的探針中,所有探針在染色后都需要洗滌步驟。我們知道對(duì)于細(xì)胞來說,輕微的刺激可能會(huì)引起細(xì)胞的形態(tài)甚至是生理變化,如洗滌。所以,在第四章中本論文設(shè)計(jì)合成了一種免洗型的RNA探針。具有良好轉(zhuǎn)子性質(zhì)的MOBTⅠ通過簡(jiǎn)單孵育20 min就可以進(jìn)入SiHa,HeLa和BMSC細(xì)胞中,無須洗滌可直接到共焦顯微鏡和雙光子熒光顯微鏡上觀察3種細(xì)胞內(nèi)的RNA。無論是收集綠光還是紅光,都可以清楚的看到細(xì)胞內(nèi)RNA的分布情況。而且MOBTⅠ無論是在單光子成像還是雙光子成像是都比商業(yè)化的探針SYTO RNA-Select表現(xiàn)出強(qiáng)的耐光性。最后,設(shè)計(jì)合成了探測(cè)線粒體膜電位的免洗型雙光子紅光探針。線粒體膜電位(MMP)是代表線粒體功能的一個(gè)很重要的參數(shù)。它的降低意味著線粒體電子運(yùn)輸鏈的破壞,這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的功能紊亂甚至是死亡。因此,MMP不同狀態(tài)的反饋,如正常、降低和消失,對(duì)于生物醫(yī)學(xué)研究和相關(guān)疾病的診斷尤其有用。到目前為止,主要有兩種探針:(1)熒光強(qiáng)度探針(例如羅丹明123,TMRE和TMRM),但是這些探針僅用熒光成像很難區(qū)分MMP降低或者消失。(2)熒光比色探針(例如JC-1),在每次實(shí)驗(yàn)之前JC-1的染色濃度需要重復(fù)調(diào)試,當(dāng)用低濃度染色時(shí),很難形成J聚集;而高濃度由于水溶性較差又會(huì)形成塊狀沉淀,這將為測(cè)試帶來極大的不便。正如前幾章介紹的一樣,洗滌會(huì)影響細(xì)胞的狀態(tài),甚至是生理特征,這樣會(huì)影響MMP,給測(cè)試結(jié)果帶來一定的誤差。在第五章中,本論文設(shè)計(jì)合成了兩個(gè)雙光子紅光陽離子鹽化合物HMOBTⅠ和ASHTⅠ。兩種化合物具有良好的轉(zhuǎn)子特性,在染色細(xì)胞的時(shí)候可以免洗。當(dāng)MMP變化時(shí),HMOBTⅠ和ASHTⅠ可以從線粒體分別靶向RNA或者核酸(NA)。這樣通過細(xì)胞內(nèi)的熒光位置變化可以輕易地看到MMP的變化。具有轉(zhuǎn)子特性的兩種化合物在染色細(xì)胞時(shí)無需洗滌,可以給出MMP變化的準(zhǔn)確信息。綜上,本論文設(shè)計(jì)合成了一些雙光子紅光探針用來高保真成像細(xì)胞器及RNA。基于轉(zhuǎn)子的這些探針在染色細(xì)胞的時(shí)候可以免洗,不但減少了對(duì)細(xì)胞的傷害,而且可以給出靶標(biāo)的準(zhǔn)確信息,尤其是像線粒體和細(xì)胞膜這種形態(tài)時(shí)時(shí)刻刻都在變化的細(xì)胞器。這為實(shí)現(xiàn)線粒體探針,細(xì)胞膜探針以及RNA探針商業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q2-33;O657.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Carbazole tricationic salt:A novel potential two-photon fluorescent DNA probe for nucleic imaging of cells[J];Chinese Science Bulletin;2010年32期

2 于曉強(qiáng);陶緒堂;蔣民華;;雙光子生物熒光顯微技術(shù)中的探針問題[J];大學(xué)化學(xué);2008年01期

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本文編號(hào)：1348856