本文關(guān)鍵詞：BRD4溴結(jié)構(gòu)域抑制劑促進(jìn)人單純皰疹病毒復(fù)制及其機(jī)理研究　出處：《南京大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 單純皰疹病毒 表觀遺傳調(diào)控 JQ1 BRD4 正性轉(zhuǎn)錄延伸因子

【摘要】：人單純皰疹病毒(human herpes simplex virus,HSV)是一類具有囊膜結(jié)構(gòu)的線性雙鏈DNA病毒,是引起人類皮膚性疾病最常見的病原體。根據(jù)血清型不同,該病毒可分為Ⅰ型和Ⅱ型(HSV-1和HSV-2)。HSV-1主要感染面部的皮膚和黏膜,引起口齦炎、皰疹性角膜炎、皮膚皰疹性濕疹。HSV-2主要感染生殖器部位的皮膚和黏膜,導(dǎo)致生殖器皰疹,是性傳播疾病(STD)的主要病原體,還能顯著增加HIV(human immunodeficiency virus)感染的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),截至2012年,全球50歲以下人口中,約有2/3人數(shù)感染過HSV-1,而在15-49歲人群中,有超過5.5億人有生殖器皰疹病毒感染。HSV感染具有溶細(xì)胞感染(lyticinfection)和潛伏感染(latentinfection)兩種形式。溶細(xì)胞感染,也稱裂解性感染,是指HSV感染上皮細(xì)胞后,進(jìn)行復(fù)制,引起細(xì)胞發(fā)生病變(cytopathiceffect,CPE)直至裂解死亡。與此同時(shí),部分病毒沿軸突上行至神經(jīng)節(jié)潛伏,在神經(jīng)元細(xì)胞中建立潛伏感染。潛伏期的HSV在宿主細(xì)胞中不進(jìn)行復(fù)制,但過度勞累或免疫力下降等因素可以將潛伏的HSV病毒激活,導(dǎo)致病毒遷移至上皮細(xì)胞造成再次感染,這是造成HSV反復(fù)感染的主要原因。HSV如何建立和維持潛伏感染,以及再激活的機(jī)制都尚不清楚。HSV感染必須借助宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)自身基因的表達(dá),而這一過程自然會(huì)受到宿主轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的調(diào)控。文獻(xiàn)中對(duì)于宿主轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)調(diào)控病毒基因表達(dá)的作用機(jī)制雖然有比較細(xì)致的描述,但是對(duì)于HSV感染以及潛伏—再激活轉(zhuǎn)換的分子機(jī)理缺乏了解。在溶細(xì)胞感染過程中,病毒非核小體DNA被注入細(xì)胞核,并快速環(huán)化成有組蛋白修飾的染色質(zhì),主要表現(xiàn)為基因組的甲基化和乙�；�,并且與病毒溶細(xì)胞感染過程中的復(fù)制以及病毒潛伏狀態(tài)的維持密切相關(guān)。因此組蛋白乙�；蛘呒谆蛩乜梢燥@著影響HSV復(fù)制和感染。為探究表觀遺傳調(diào)控對(duì)HSV感染的影響,本課題選擇篩選表觀遺傳學(xué)小分子化合物庫(kù)這一策略來尋找能夠?qū)θ芗?xì)胞感染過程中病毒感染復(fù)制產(chǎn)生影響的表觀遺傳調(diào)控因素。我們發(fā)現(xiàn)兩類結(jié)構(gòu)互異的小分子化合物可以顯著促進(jìn)HSV復(fù)制。除已經(jīng)報(bào)道的組蛋白去乙�；敢种苿〩DACi(Histone deacetylases inhibitor,HDACi)外,我們還發(fā)現(xiàn) BET 家族蛋白溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain,BD)抑制劑,包括 PFI-1,(+)-JQ1,I-BET-762 等能夠顯著促進(jìn) HSV-1 和 HSV-2 溶細(xì)胞感染。JQ-1 是BRD4(Bromdomain-containing protein4,BRD4)選擇性抑制劑,其通過與BRD4的BD區(qū)(bromodomain,BD)結(jié)合,阻斷BRD4與乙�；嚢彼峤Y(jié)合,從而抑制宿主細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄。作為一個(gè)多結(jié)構(gòu)域蛋白,BRD4的C末端結(jié)構(gòu)域能夠與正性轉(zhuǎn)錄延伸因子(Positive transcription elongation factor,P-TEFb)結(jié)合形成具有轉(zhuǎn)錄活性的復(fù)合物。為了進(jìn)一步研究BRD4溴結(jié)構(gòu)域抑制劑促HSV復(fù)制的機(jī)制,我們首先研究了 BRD4在HSV溶細(xì)胞感染中的作用。用siRNA抑制細(xì)胞BRD4蛋白表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)抑制BRD4表達(dá)能夠明顯抑制病毒復(fù)制,提示BRD4是HSV溶細(xì)胞感染所需要的宿主因子;通過免疫共沉淀以及免疫熒光染色方法,我們發(fā)現(xiàn)HSV感染誘導(dǎo)BRD4與P-TEFb亞單元CDK9結(jié)合,并且與DNA依賴性RNA聚合酶(RNAPII)形成復(fù)合物,JQ-1處理可以增加這些復(fù)合物的形成,表明JQ-1可能通過BRD4及蛋白復(fù)合物形成而加速病毒mRNA延伸過程;最后,通過染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄復(fù)合物能夠定位于病毒基因啟動(dòng)子區(qū),與之相對(duì)應(yīng)的是JQ1處理能夠增加該復(fù)合物在HSV基因啟動(dòng)子區(qū)富集。由于JQ-1是作用機(jī)制相對(duì)清楚的小分子探針,其主要通過阻斷BD域與乙�；嚢彼峤Y(jié)合,影響組蛋白乙�；揎椉八拗骷�(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄過程,因此我們研究了過表達(dá)BRD4結(jié)構(gòu)域在HSV感染中的作用,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)BD1(aa1-196),BD1/2(aa 1-640)以及C端結(jié)構(gòu)域(aa 197-1362)能不同程度地促進(jìn)HSV感染。這些結(jié)果表明BRD4在基因轉(zhuǎn)錄方面調(diào)控HSV溶細(xì)胞感染過程�；瘜W(xué)生物學(xué)是90年代新興的一門學(xué)科,其特點(diǎn)之一是將小分子作為工具發(fā)現(xiàn)生命過程中的復(fù)雜生物學(xué)問題。小分子化合物探針具有作用靶點(diǎn)專一、作用機(jī)制相對(duì)清楚的特點(diǎn),因此可以用于發(fā)現(xiàn)調(diào)控生命過程的重要分子靶點(diǎn)、構(gòu)建蛋白作用網(wǎng)絡(luò)。本研究通過篩選表觀遺傳學(xué)小分子化合物庫(kù)發(fā)現(xiàn)BRD4蛋白溴結(jié)構(gòu)域抑制劑能夠促進(jìn)人單純皰疹病毒的溶細(xì)胞感染,并以小分子抑制劑JQ1為工具,同時(shí)結(jié)合病毒學(xué)、細(xì)胞分子生物學(xué)以及化學(xué)生物學(xué)的研究方法,首次發(fā)現(xiàn)并證明了在HSV溶細(xì)胞感染過程中,BRD4蛋白參與了病毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,并初步探明了 JQ1能夠促進(jìn)HSV溶細(xì)胞感染復(fù)制的作用機(jī)制。這些工作為今后深入地理解和研究細(xì)胞對(duì)HSV基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Human herpes simplex virus (HSV) is a class of linear double stranded DNA viruses with envelope structure. It is the most common pathogen causing skin diseases in humans. According to the different serotypes, the virus can be divided into type I and type II (HSV-1 and HSV-2). HSV-1 mainly infects the facial skin and mucous membrane, cause gingivitis, herpes simplex keratitis, skin eczema. HSV-2 mainly infects skin and mucosa of genital organs, leading to genital herpes. It is the main pathogen of sexually transmitted disease (STD), and it can also significantly increase the risk of HIV (human immunodeficiency virus) infection. According to statistics from WHO (World Health Organization, WHO), by the year 2012, about 50 of the world's population under the age of 15-49 had been infected with HSV-1, while in the age of 15-49, more than 550 million people had genital herpes virus infection. HSV infection has two forms of cytolytic infection (lyticinfection) and latent infection (LATENTINFECTION). Cytolytic infection, also known as cleavage infection, refers to the replication of HSV infected epithelial cells, causing cell lesions (cytopathiceffect, CPE) until lysis and death. At the same time, some viruses move along the axon to the ganglion, and the latent infection is established in the neuron cells. The latent period of HSV does not replicate in host cells, but excessive fatigue or decreased immunity can activate the latent HSV virus, leading to the migration of virus to epithelial cells, resulting in re infection, which is the main reason for HSV repeated infection. It is not clear how HSV establishes and maintains latent infection, and the mechanism of reactivation. HSV infection must use the transcriptional system of the host cell to realize the expression of its own genes, and this process is naturally regulated by the host transcriptional system. Although there is a detailed description of the mechanism of host transcriptional system regulating viral gene expression, there is a lack of understanding about the molecular mechanism of HSV infection and latency reactivation transformation. In the process of cytolytic infection, virus non nucleosome DNA was injected into the nucleus, and quickly cyclizes with chromatin histone modification, mainly for genome methylation and acetylation, and viral cytolytic infection during replication and virus latency is closely related to the maintenance of. Therefore, the factors of histone acetylation or methylation can significantly affect HSV replication and infection. To explore the effect of epigenetic regulation on HSV infection, we screened the epigenetic small molecule library strategy to find epigenetic regulation factors that influence the replication of viral infection during lytic infection. We found that two types of small molecular compounds with different structures can significantly promote HSV replication. In addition to the already reported histone deacetylase inhibitor HDACi (Histone deacetylases inhibitor, HDACi), we also found that BET protein family bromodomain (bromodomain, BD) inhibitors, including PFI-1, -JQ1, I-BET-762 (+) HSV-1 and HSV-2 could significantly promote the cytolytic infection. JQ-1 is a selective inhibitor of BRD4 (Bromdomain-containing protein4, BRD4), which blocks the binding of BRD4 to acetylated lysine through binding with BD region (bromodomain, BD) of BRD4, thereby inhibiting the gene transcription of host cells. As a multi domain protein, the C terminal domain of BRD4 can bind to Positive transcription elongation factor (P-TEFb) to form a transcriptional complex. In order to further study the mechanism of BRD4 bromine domain inhibitor to promote HSV replication, we first studied the role of BRD4 in HSV cell infection. The inhibition of BRD4 protein expression by siRNA, we found that inhibition of BRD4 expression can inhibit virus replication, suggesting that BRD4 is a host factor HSV cytolytic infection in need; by CO immunoprecipitation and immunofluorescence staining methods, we found that HSV infection induced by combination of BRD4 and P-TEFb subunits and CDK9 dependent RNA polymerase (RNAPII and DNA) complex formation, formation of JQ-1 treatment can increase these complexes, indicating that JQ-1 may through BRD4 and protein complex formation and accelerated viral mRNA extension process; finally, by chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments we found that the transcription complex to the promoter region of the virus gene localization, corresponding to the JQ1 treatment can increase the complexes in the promoter region of HSV gene enrichment. Because JQ-1 is a small molecule probe mechanism is relatively clear, mainly by blocking the BD domain and the acetyl lysine binding effect, histone modification and host cell gene transcription process, we studied the expression of BRD4 domain in HSV infection, the expression of BD1 (aa1-196). BD1/2 (AA 1-640) and C terminal domain (AA 197-1362) can be promoted HSV infection. These results suggest that BRD4 regulates the process of HSV cell infection in gene transcription. Chemical biology is a newly emerging subject in the 90s. One of its features is the discovery of small molecules as a tool for the discovery of complex biological problems in the life process. Small molecule probes have specific targets and relatively clear mechanisms, so they can be used to identify important molecular targets for regulating life processes and construct protein interaction networks. This study through screening epigenetic small molecular library found BRD4 protein bromodomain inhibitors can promote human herpes virus cytolytic infection, and small molecule inhibitors of JQ1 as a tool, combined with the virology, molecular cell biology and chemical biology research methods, first discovered and proved in HSV cytolytic infection process BRD4, the transcriptional regulation of proteins involved in viral genes, the mechanism and preliminary verified JQ1 can promote HSV cytolytic replication. These work for the future to understand and study the cell to H
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R373

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