本文關鍵詞：Orexin神經肽和去甲腎上腺素對腦橋尾側網狀核神經元活動調控的研究　出處：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：運動是在神經系統(tǒng)中多種運動相關神經元精密協(xié)同下完成的一項重要生理功能。其中,腦橋尾側網狀核(caudal pontine reticular nucleus,PnC)的網狀脊髓神經元(reticulospinal neurons)作為重要的“橋梁”,廣泛轉接來自皮層、中腦、腦干和小腦的不同運動信息并直接調控脊髓運動神經環(huán)路活動,在中樞多種運動行為中均發(fā)揮重要作用。既往研究表明,損毀Pn C會導致軀體姿勢及肌張力調節(jié)異常,說明Pn C可能是中樞介導姿勢及肌張力調節(jié)的重要腦區(qū)。姿勢及肌張力調節(jié)受到多種生理功能狀態(tài)的影響。很有意思的是,通過睡眠剝奪影響受試者覺醒狀態(tài)會對其姿勢及肌張力的正常維持造成顯著損害,表明軀體姿勢及肌張力正常調節(jié)依賴于良好的覺醒狀態(tài)。業(yè)已證實,機體覺醒狀態(tài)的啟動及維持依賴于皮層下多種促覺醒系統(tǒng)的活動。不同覺醒系統(tǒng)間相互聯(lián)系形成復雜網絡,由該網絡發(fā)出的覺醒纖維廣泛支配了整個神經系統(tǒng)。其中,運動腦區(qū)同樣受到覺醒纖維的支配,表明代表覺醒信息的覺醒遞質可以直接調控運動腦區(qū)活動,并參與中樞運動行為執(zhí)行。值得注意的是,下丘腦orexin系統(tǒng)的缺陷可以直接導致猝倒(cataplexy)這一機體軀體姿勢及肌張力調節(jié)障礙的疾病,且LC-NA能系統(tǒng)在猝倒發(fā)作時突然停止活動,表明下丘腦orexin能系統(tǒng)和LC-NA能系統(tǒng)在正常覺醒狀態(tài)下姿勢及肌張力的調節(jié)中存在重要作用。已有研究表明,下丘腦orexin能系統(tǒng)和腦干LC-NA能系統(tǒng)可以通過不同機制調控中樞(包括脊髓、外側前庭核和小腦等)姿勢及肌張力調節(jié)相關腦區(qū)的活動,并參與覺醒狀態(tài)下正常姿勢及肌張力的調節(jié)。既然如此,PnC作為中樞姿勢及肌張力調節(jié)的重要腦區(qū)是否也受到下丘腦orexin能系統(tǒng)和腦干LC-NA能系統(tǒng)的調控成為本文的主要關注點。以往的形態(tài)學研究表明,orexin能以及NA能纖維均在Pn C中有豐富的分布,然而該投射的功能目前尚不明確。因此在相關部分實驗中,我們首先采用western blot以及免疫組織化學技術對Pn C腦區(qū)中orexin以及NA能受體的分布進行了檢測。在此基礎上進一步采用膜片鉗結合神經藥理學方法觀測比較了orexin和NA對Pn C網狀脊髓神經元全細胞電流活動的影響并分別揭示了其機制。有意思的是,orexin和NA均能通過直接的突觸后機制調控Pn C網狀脊髓神經元的活動,表明PnC可能是orexin和na參與運動功能調控的重要腦區(qū)。在上述基礎上,本文首先圍繞下丘腦orexin能系統(tǒng),對其在pnc中的作用進行了系統(tǒng)的研究。我們進一步觀測了orexin對pnc網狀脊髓神經元突觸傳遞,包括微小興奮性突觸后電流(miniatureexcitatorypost-synapticcurrent,mepsc)和微小抑制性突觸后電流(miniatureinhibitorypost-synapticcurrent,mipsc)的影響及機制。在明確orexin對pnc網狀脊髓神經元的突觸前及突觸后調控效應及機制的基礎上,我們進一步結合神經藥理學和行為學技術解答了orexin突觸前/后的不同調控效應如何分別參與了對pnc網狀脊髓神經元所介導的聲音震驚反射(acousticstartleresponse,asr)這一姿勢控制行為的調控。本文主要研究結果總結如下:1.orexin和na能受體在pnc中的分布。orexin及na能纖維分布于pnc中,但其受體表達情況尚不清楚。本文首先采用免疫組織化學及westernblot方法,分別對其受體在pnc中的表達進行了檢測。orexin-2型受體已被證明存在于pnc中。利用免疫熒光技術檢測發(fā)現,orexin-1型受體同樣在pnc中存在豐富表達。我們接下來應用westernblot技術對na能受體的不同亞型在pnc中的分布進行檢測。westernblot結果表明,na能不同受體亞型,包括α1a、α1b、α1d、α2a、α2b和α2c受體,在pnc中均有表達。應用免疫酶標的方法,本研究同時對na能受體在pnc神經元中的分布進行了檢測。同樣,上述不同na能受體亞型均表達于pnc網狀脊髓神經元中。以上實驗結果表明,orexin和na能受體均表達于pnc中,提示orexin和na可以通過作用于這些受體調控pnc神經元活動。2.orexin和na對pnc網狀脊髓神經元全細胞電流活動的影響。接下來,通過全細胞膜片鉗技術并結合神經藥理學手段,我們在根據形態(tài)(胞體長軸直徑大于35μm)和電生理鑒定的pnc網狀脊髓神經元中直接觀測比較了orexin和na對其全細胞電流活動的影響。(1)orexin在pnc網狀脊髓神經元中誘發(fā)內向電流反應。在所有測試的107例pnc網狀脊髓神經元中,acsf灌流orexin-a(30-300nm)均誘導出穩(wěn)定的內向電流反應。此外orexin在pnc網狀脊髓神經元中所誘發(fā)的內向電流反應存在明顯的劑量依賴效應:30、100和300nm的orexin-a所誘發(fā)的內向電流反應幅度分別為29.8±9.1pa(n=4)、39.8±4.5pa(n=11)和50.6±5.8pa(n=11)。該部分結果表明,orexin對pnc網狀脊髓神經元的活動存在的興奮性調節(jié)作用。(2)na在一部分pnc網狀脊髓神經元誘發(fā)內向電流反應,在另一部分卻誘發(fā)外向電流反應。采用同樣的方法,我們觀察了na對pnc網狀脊髓神經元全細胞電流的調控效應。有趣的是,與orexin的作用模式不同,na(3μm)在一部分(33/51例,64.7%)測試的神經元中誘導出內向電流反應,而在剩下的(18/51例,35.3%)神經元中則誘導出外向電流反應。同時,na所誘導的內向和外向電流反應在(1-10μm)測試濃度范圍內均呈現出穩(wěn)定的劑量依賴效應。在9例對na表現出內向反應的pnc網狀脊髓神經元中,1、3和10μmna誘發(fā)的內向電流反應幅度分別為-20.8±3.8pa(n=8)、-34.9±6.2pa(n=9)和-46.5±7.3pa(n=7)。而在另外9例對na表現出外向反應的pnc網狀脊髓神經元中,1、3和10μmna引起的外向電流反應幅度分別為21.3±6.4pa(n=8)、30.9±6.8pa(n=9)和34.3±6.7pa(n=9)。上述結果表明,orexin和na均能調節(jié)pnc網狀脊髓神經元的全細胞電流活動。然而,與orexin的一致興奮性調節(jié)模式不同,na對pnc網狀脊髓神經元活動的調控更為復雜,包括興奮和抑制兩種形式。3.orexin和na通過突觸后機制,調控pnc網狀脊髓神經元全細胞電流活動。(1)orexin通過激活突觸后orexin-1型和orexin-2型受體,在pnc網狀脊髓神經元誘導出內向電流。acsf中加入ttx(1μm)對orexin所誘發(fā)的內向電流反應的幅度并無顯著影響(n=6,p=0.995),說明該效應主要由突觸后機制所介導。acsf中加入orexin-1型受體特異性阻斷劑sb334867(10μm)僅部分阻斷了orexin-a(100nm)所誘發(fā)的內向電流反應(n=4,p0.01)。而在acsf中加入orexin-1型及orexin-2型受體的聯(lián)合阻斷劑tcs1102(1μm)則可完全阻斷orexin-a(100nm)所誘發(fā)的內向電流反應(n=6,p0.01)。上述結果共同表明,orexin通過激活突觸后orexin-1及orexin-2型受體,對pnc網狀脊髓神經元進行興奮性調控。(2)非選擇性陽離子通道(non-selectivecationchannels,nsccs)的開放介導了orexin對pnc網狀脊髓神經元的突觸后效應。中樞神經系統(tǒng)中與orexin受體活化相偶聯(lián)的離子通道包括k+通道、na+-ca2+交換體以及nsccs三種。我們首先在加入orexin-a(100nm)前后,對記錄的pnc網狀脊髓神經元進行緩慢的斜坡電壓(slowramp)刺激(范圍:-125~-55mv,斜率:+10mv/s),并得到其分別對應的全細胞電流的i-v曲線關系。在8例測試的神經元中,對照與加入orexin-a后的全細胞電流均未出現交點,在5/8例神經元中,orexin-a與對照組的全細胞電流呈現出平行狀態(tài);在剩下的3/8例神經元中,兩者則隨著刺激電壓的增大而呈現出在大于-55mv方向的相交趨勢�？紤]到在我們實驗條件下應用能斯特方程(nernstequation)計算所得的k+平衡電位為-102.3mv,因此k+通道可能并非介導orexin-a所誘發(fā)內向電流的主要成分。進一步擴大斜坡電壓刺激范圍(范圍:-125~+5mv,斜率:+10mv/s)后,我們發(fā)現在絕大多數(9/10例)測試的神經元中,orexin-a所誘發(fā)凈電流的平衡電位水平位于-27.2±2.7mv(n=9),接近于nsccs電導的平衡電位水平。在僅有一例測試的神經元中,該電流平衡電位為-99.7mv。該結果表明,在絕大多數pnc網狀脊髓神經元中,orexin-a所誘發(fā)的內向電流反應由下游nsccs的開放所介導,而k+通道可能僅在極少數pnc網狀脊髓神經元上參與了orexin-a所誘發(fā)的內向電流反應,并非主要成分。考慮到nsccs開放通透na+和k+,我們進一步采用離子置換實驗對上述推論進行了驗證。acsf中na+濃度從152.25mm降低至27mm后,orexin-a(100nm)在pnc網狀脊髓神經元中所引起的內向電流反應幅度顯著減小(n=7,p0.01)。進一步在acsf中加入nsccs的阻斷劑flufenamicacid(100μm)同樣可以顯著降低orexin-a(100nm)所引起的內向電流反應幅度(n=5,p0.01),而na+-ca2+交換體阻斷劑sn-6對orexin-a(100nm)所誘發(fā)的內向電流反應無顯著影響(n=4,p=0.746)。上述結果表明,orexin-a在pnc網狀脊髓神經元中所誘發(fā)的內向電流反應主要由nsccs的開放所介導,而k+通道可能在極少數神經元中參與了這一反應,但并非主要成分。(3)na通過突觸后共表達的α1和α2受體,調控pnc網狀脊髓神經元全細胞電流活動。在闡明了orexin調控pnc網狀脊髓神經元全細胞電流活動的受體及離子通道基礎上,我們進一步對na在pnc網狀脊髓神經元發(fā)揮效應的受體和離子機制進行了研究。由于該部分工作與實驗室他人合作共同完成,在此僅詳述我本人完成的受體機制部分工作。結合藥理學手段我們對na發(fā)揮前述效應的受體機制分別進行了研究。在7例對na呈現內向反應的pnc網狀脊髓神經元中,α1受體的特異性阻斷劑prazosin(pra,0.01μm)部分阻斷了na(3μm)所引起的內向電流反應(n=7,p0.05)。該結果表明,突觸后α1受體參與了na所誘發(fā)的內向電流反應。然而acsf中加入10μmpra后,在完全阻斷上述內向電流反應的同時,na在同一神經元中誘發(fā)出了穩(wěn)定的外向電流反應(平均幅度:23.5±5.1pa,n=7)。進一步在acsf中加入α2受體的特異性阻斷劑yohimbine(yh,10μm)方可完全阻斷na在此神經元上所引起的反應(p0.01)。上述結果表明,na在pnc網狀脊髓神經元中所誘發(fā)的整體內向電流其實包含有2種成分:一是α1受體激活所產生的內向電流成分;二是α2受體激活所產生的外向電流成分。上述兩種成分整合后,表現出na所引起的內向電流反應。在另外6例對na呈現出外向反應的pnc網狀脊髓神經元中,yh(0.1μm)部分阻斷了na(3μm)所引起的外向電流反應(n=6,p0.01)。該結果表明,突觸后α2受體參與了na所誘發(fā)的外向電流反應。acsf中加入10μmyh后,在完全阻斷上述外向電流反應的同時,na在同一神經元中誘發(fā)出了穩(wěn)定的內向電流反應(平均幅度:-13.7±2.3pa,n=6)。進一步在acsf中加入pra(10μm)方可完全阻斷na在此神經元上所引起的反應(p0,01)。上述結果共同表明,α1和α2受體共表達于單個pnc網狀脊髓神經元中,其激活可以分別產生內向及外向電流成分,兩種成分的不同整合介導了na對pnc網狀脊髓神經元興奮和抑制性調控。與此一致,我們的免疫熒光雙標結果表明,α1a和α2a受體亞型的確共表達于單個pnc網狀脊髓神經元中。4.orexin對pnc網狀脊髓神經元mepsc和mipsc突觸傳遞的影響及機制。在本部分工作中,我們首先以orexin-a系統(tǒng)為中心,進一步探索了其對pnc網狀脊髓神經元突觸傳遞影響及機制。通過藥理學手段,我們分離出了代表突觸前興奮性信息自發(fā)釋放的mepsc和代表突觸前抑制性信息自發(fā)釋放的mipsc。(1)orexin抑制pnc網狀脊髓神經元mepsc的頻率,但對mipsc無顯著影響。在測試的9例pnc網狀脊髓神經元中,orexin-a(300nm)既不影響mipsc的平均頻率(n=9,p=0.469),也不影響其平均幅度(n=9,p=0.653),說明orexin-a對pnc網狀脊髓神經元突觸前抑制性信息釋放并無顯著影響。在另外8例神經元中,我們發(fā)現orexin-a(300nm)可以顯著抑制mepsc的頻率(n=8,p0.01),但不影響其幅度(n=8,p=0.501),該結果表明orexin可以通過突觸前的機制對pnc網狀脊髓神經元突觸前興奮性信息釋放進行抑制性調控。(2)orexin通過動員內源性大麻素系統(tǒng),抑制pnc網狀脊髓神經元mepsc的頻率。在acsf中加入大麻素1型受體(canabinoidtype1receptor,cb1r)的特異性阻斷劑am251(1μm)后,上述orexin-a(300nm)對mepsc頻率的抑制效應被完全阻斷(n=8,p=0.521),而mepsc的幅度仍然不受影響(n=8,p=0.114)。綜上,該部分結果證明orexin可以通過動員內源性大麻素系統(tǒng),通過激活突觸前谷氨酸末梢cb1受體,對pnc網狀脊髓神經元谷氨酸的釋放進行抑制性調控。與電生理實驗結果相一致,我們的免疫熒光結果表明內源性大麻素合成限速酶diacylglycerollipaseα(daglα)在pnc網狀脊髓神經元中均存在豐富的表達。5.orexin的突觸前抑制效應參與了對crn功能性傳入(crn-eepscs)的抑制。在上述闡明orexin抑制pnc網狀脊髓神經元mepsc的基礎上,我們進一步想知道該突觸前效應是否在功能活動層次參與了對pnc網狀脊髓神經元所接收到的功能性興奮傳入的調控。通過電刺激crn,我們在pnc網狀脊髓神經元中記錄到了crn-eepscs。在acsf中灌流orexin-a(300nm)顯著抑制了刺激所誘發(fā)的eepsc1的幅度(n=10,p0.01)。并且該抑制效應同時伴隨著eepsc2/eepsc1比值的增大(n=10,p0.01),提示orexin-a可以通過突觸前的機制對crn興奮性信息的傳入進行抑制性調控。進一步在acsf中加入am251(1μm)后,上述orexin-a對eepsc1幅度的抑制效應幾乎被完全阻斷了(n=6,p=0.203),同時eepsc2/eepsc1比值也不在發(fā)生變化(n=6,p=0.841)。綜上所述,該部分結果說明,上述orexin對pnc網狀脊髓神經元mepsc的抑制效應同樣在功能層次參與了對功能性興奮傳入的抑制性調控6.orexin對pnc網狀脊髓神經元的突觸后及突觸前調控效應在行為水平參與了對asr姿勢控制行為的調節(jié)。在上述研究發(fā)現基礎上,我們進一步在行為水平觀察了orexin對pnc網狀脊髓神經元介導的asr行為的影響。結果表明,pnc腦區(qū)雙側微量注射30μmorexin-a在不同聲音刺激強度(94-112db)下均顯著增大了asr反應幅度。這與orexin-a對pnc網狀脊髓神經元突觸后的興奮效應相一致。但pnc腦區(qū)雙側微量注射3μmorexin-a在較小的94db聲音刺激時卻顯著抑制了asr反應幅度(p0.01,n=13)。有意思的是,在注射3μmorexin-a的同時注射am251(1mm)阻斷orexin-a對pnc網狀脊髓神經元的突觸前抑制效應后,3μmorexin-a在94db時對asr發(fā)生幅度的抑制效應被完全阻斷。該結果表明,在orexin-a濃度較低且外界傳入聲音強度較弱時,orexin-a對突觸前興奮信息傳入的抑制效應大于對突觸后的興奮效應,使得其整合后在行為水平表現為抑制asr反應。與此相一致,我們進一步發(fā)現30μmorexin-a對于asr的閾值并無顯著影響(n=9,p=0.347);但3μmorexin-a卻顯著增加了asr發(fā)生的閾值(n=9,p=0.347)。該部分結果不僅表明orexin-a對pnc網狀脊髓神經元的突觸前、后調節(jié)效應分別參與了對其幅度和閾值的調控,同時也提示在不同生理情況下,這兩者在神經元活動及行為層次的整合可以促進pnc網狀脊髓神經元對較強刺激做出快速有效反應,并同時過濾噪聲傳入信息的影響,進而促進相應運動行為的高效準確執(zhí)行。綜上所述,本文揭示了orexin和na均可通過直接的突觸后效應對pnc網狀脊髓神經元活動進行調控。其中,orexin通過激活突觸后orexin-1及orexin-2受體,并開放nsccs對pnc網狀脊髓神經元進行興奮性調控。而與orexin不同,na通過激活共表達與pnc網狀脊髓神經元突觸后的α1和α2受體,對pnc網狀脊髓神經元可以進行興奮或抑制性的雙向調控。在此基礎上,我們首先系統(tǒng)解答了orexin在pnc中作用的生理意義。Orexin不僅通過突觸后機制對PnC網狀脊髓神經元進行興奮性調控,同時通過動員內源性大麻素系統(tǒng)對其突觸前興奮信息的傳遞進行抑制性調控。該突觸前/后調控效應均在行為層次參與了對ASR行為的調節(jié)。通過上述實驗,我們系統(tǒng)揭示了orexin通過調控Pn C網狀脊髓神經元活動,可以促進機體對較強刺激做出快速有效反應,并同時過濾噪聲傳入信息的影響,進而促進相應運動行為的高效準確執(zhí)行。本文研究為中樞覺醒系統(tǒng)參與運動提供了新的中樞神經機制,并為理解與覺醒系統(tǒng)異常相關運動疾病的發(fā)病機制提供了新的研究方向。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R338

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本文編號：1328425