本文關(guān)鍵詞：低強(qiáng)度激光（LLL）對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的生物學(xué)效應(yīng)研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：光生物調(diào)節(jié)(PBM)通過(guò)光線(xiàn)影響內(nèi)源光感受器的活性,激活線(xiàn)粒體逆行信號(hào)傳導(dǎo)途徑改變細(xì)胞增殖和代謝。低水平激光(LLL)是用于光生物調(diào)節(jié)的常見(jiàn)光源。光譜中這個(gè)區(qū)域中的光可以穿透組織且不具有致癌性質(zhì)。低水平激光(LLL)已作為非侵入性物理治療應(yīng)用于臨床,例如骨質(zhì)疏松癥,通過(guò)改變骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的狀態(tài)來(lái)發(fā)揮作用。由于光療法廣泛用于醫(yī)學(xué),干細(xì)胞療法和光療法的組合似乎是一個(gè)更加明智的選擇。LLL對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hADSCs)的效應(yīng)機(jī)制仍有待研究。一種可能的機(jī)制是線(xiàn)粒體呼吸鏈中的細(xì)胞色素C氧化酶參與光子吸收。微陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)輻照后涉及能量產(chǎn)生和細(xì)胞抗氧化保護(hù)途徑的基因表達(dá)顯著上調(diào)。在本文的第一部分,我們?cè)u(píng)估了LLL對(duì)細(xì)胞活力,遷移,抗凋亡能力的影響以及探討了相關(guān)機(jī)制。使用MTS測(cè)量細(xì)胞增殖,并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期。通過(guò)TEM、FCM、QRT-PCR和免疫熒光評(píng)價(jià)LLL對(duì)線(xiàn)粒體生物發(fā)生(分裂和融合)和功能(ATP,ROS,NO)的影響。使用transwell、免疫熒光、ELISA和Westernblot評(píng)估細(xì)胞遷移和細(xì)胞骨架改變(肌動(dòng)蛋白和微管蛋白)。使用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光和Westernblot評(píng)估細(xì)胞凋亡。我們研究了低水平激光(LLL)LLL照射1小時(shí)后繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)或24小時(shí)后MSCs上述各項(xiàng)指標(biāo)的變化。作用機(jī)制包括增殖速率增加介導(dǎo)的S期比例上調(diào);通過(guò)融合(Mfn1,Mfn2和Opa-1)和分裂(Fis1,Drp-1和MTP18)相關(guān)蛋白介導(dǎo)的線(xiàn)粒體生物發(fā)生,以及NRF1,TFAM,PGC-1a表達(dá)上調(diào)和細(xì)胞內(nèi)ROS和NO濃度變化介導(dǎo)的線(xiàn)粒體功能改變;通過(guò)ERK1/2和FAK途徑以及生長(zhǎng)因子如HGF和PDGF的上調(diào)引起細(xì)胞遷移加速;通過(guò)增加Bcl-2和降低Bax蛋白表達(dá)量,或者LLL處理的MSC與5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)凋亡的MSC之間形成隧道納米管(TNT)來(lái)抵抗凋亡。MSCs在動(dòng)物模型和臨床上獲得了良好治療效果,對(duì)于MSCs和基于它的產(chǎn)品在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用將會(huì)被持續(xù)探討。MSCs促進(jìn)組織救援/治療的機(jī)制包括:(1)涉及到蛋白/多肽以及激素分泌的旁分泌作用;(2)通過(guò)隧道納米管或者微囊泡轉(zhuǎn)移線(xiàn)粒體;(3)通過(guò)外泌體exosomes轉(zhuǎn)移RNA等分子。MSC被募集到應(yīng)激或炎癥部位以實(shí)現(xiàn)其修復(fù)功能。MSCs的免疫調(diào)節(jié)不是自發(fā)的,需要“授權(quán)”或激活來(lái)發(fā)揮其免疫抑制作用。MSCs表面表達(dá)Toll樣受體(TLR),TLR信號(hào)傳導(dǎo)參與MSCs的許可。MSC表面表達(dá)的TLR3和TLR4可分別被雙鏈RNA如polyl:C和脂多糖LPS所激活�；罨疶LR4信號(hào)后MSCs會(huì)釋放增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子(IL-6,IL-8和TGF-b等)從而極化成MSC1型促炎細(xì)胞,MSC1型細(xì)胞能活化T細(xì)胞;相反,激活TLR3信號(hào)后,MSCs會(huì)產(chǎn)生抑制炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子(IDO,PGE-2,IL-4和IL-1RA)極化成MSC2抑炎細(xì)胞,MSC2型細(xì)胞具有抑制淋巴細(xì)胞增殖的能力。在本文的第二部分,我們探討了 LLL對(duì)TLR4誘導(dǎo)因子LPS介導(dǎo)的MSCs炎癥反應(yīng)的抑制作用。通過(guò)ELISA試劑盒和QRT-PCR評(píng)價(jià)炎性因子表達(dá)和分泌,用CM-H2DCFDA和DAF-FM試劑盒測(cè)量細(xì)胞內(nèi)ROS和NO含量變化,發(fā)現(xiàn)LLL降低LPS誘導(dǎo)MSC中IL-1β,IL-6,IL-8,ROS和NO的分泌。免疫熒光檢測(cè)NF-κ B在LLL照射的MSC中核易位相對(duì)于LPS誘導(dǎo)組顯著下降。Western blot分析表明,LLL通過(guò)調(diào)節(jié)p65和Iκ Bα的磷酸化抑制NF-κ B的活化。我們將純化的外周血單核細(xì)胞(PBMC)通過(guò)植物凝集素(PHA)刺激后與3種方式處理的MSCs共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),LLL處理后的MSC顯著降低淋巴細(xì)胞激活標(biāo)記CD25和CD69在PHA刺激的淋巴細(xì)胞上的表達(dá)。綜上所述,我們使用11-16 J/cm2劑量的LLL促進(jìn)MSCs的增殖,遷移和抗凋亡能力以及加強(qiáng)其抑炎作用。LLL可以作為MSC在移植前預(yù)處理手段,以達(dá)到基于干細(xì)胞治療的安全和長(zhǎng)期功效。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：1327838