本文關鍵詞：低強度激光（LLL）對間充質干細胞（MSCs）的生物學效應研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 間充質干細胞 低水平激光 增殖 線粒體 遷移 凋亡 免疫調節(jié)

【摘要】：光生物調節(jié)(PBM)通過光線影響內源光感受器的活性,激活線粒體逆行信號傳導途徑改變細胞增殖和代謝。低水平激光(LLL)是用于光生物調節(jié)的常見光源。光譜中這個區(qū)域中的光可以穿透組織且不具有致癌性質。低水平激光(LLL)已作為非侵入性物理治療應用于臨床,例如骨質疏松癥,通過改變骨髓間充質干細胞的狀態(tài)來發(fā)揮作用。由于光療法廣泛用于醫(yī)學,干細胞療法和光療法的組合似乎是一個更加明智的選擇。LLL對人脂肪間充質干細胞(hADSCs)的效應機制仍有待研究。一種可能的機制是線粒體呼吸鏈中的細胞色素C氧化酶參與光子吸收。微陣列技術發(fā)現(xiàn)輻照后涉及能量產(chǎn)生和細胞抗氧化保護途徑的基因表達顯著上調。在本文的第一部分,我們評估了LLL對細胞活力,遷移,抗凋亡能力的影響以及探討了相關機制。使用MTS測量細胞增殖,并通過流式細胞術(Flow Cytometry,FCM)檢測細胞周期。通過TEM、FCM、QRT-PCR和免疫熒光評價LLL對線粒體生物發(fā)生(分裂和融合)和功能(ATP,ROS,NO)的影響。使用transwell、免疫熒光、ELISA和Westernblot評估細胞遷移和細胞骨架改變(肌動蛋白和微管蛋白)。使用流式細胞術、免疫熒光和Westernblot評估細胞凋亡。我們研究了低水平激光(LLL)LLL照射1小時后繼續(xù)培養(yǎng)6小時或24小時后MSCs上述各項指標的變化。作用機制包括增殖速率增加介導的S期比例上調;通過融合(Mfn1,Mfn2和Opa-1)和分裂(Fis1,Drp-1和MTP18)相關蛋白介導的線粒體生物發(fā)生,以及NRF1,TFAM,PGC-1a表達上調和細胞內ROS和NO濃度變化介導的線粒體功能改變;通過ERK1/2和FAK途徑以及生長因子如HGF和PDGF的上調引起細胞遷移加速;通過增加Bcl-2和降低Bax蛋白表達量,或者LLL處理的MSC與5-氟尿嘧啶誘導凋亡的MSC之間形成隧道納米管(TNT)來抵抗凋亡。MSCs在動物模型和臨床上獲得了良好治療效果,對于MSCs和基于它的產(chǎn)品在再生醫(yī)學中的應用將會被持續(xù)探討。MSCs促進組織救援/治療的機制包括:(1)涉及到蛋白/多肽以及激素分泌的旁分泌作用;(2)通過隧道納米管或者微囊泡轉移線粒體;(3)通過外泌體exosomes轉移RNA等分子。MSC被募集到應激或炎癥部位以實現(xiàn)其修復功能。MSCs的免疫調節(jié)不是自發(fā)的,需要“授權”或激活來發(fā)揮其免疫抑制作用。MSCs表面表達Toll樣受體(TLR),TLR信號傳導參與MSCs的許可。MSC表面表達的TLR3和TLR4可分別被雙鏈RNA如polyl:C和脂多糖LPS所激活�；罨疶LR4信號后MSCs會釋放增強炎癥反應的細胞因子(IL-6,IL-8和TGF-b等)從而極化成MSC1型促炎細胞,MSC1型細胞能活化T細胞;相反,激活TLR3信號后,MSCs會產(chǎn)生抑制炎癥反應的細胞因子(IDO,PGE-2,IL-4和IL-1RA)極化成MSC2抑炎細胞,MSC2型細胞具有抑制淋巴細胞增殖的能力。在本文的第二部分,我們探討了 LLL對TLR4誘導因子LPS介導的MSCs炎癥反應的抑制作用。通過ELISA試劑盒和QRT-PCR評價炎性因子表達和分泌,用CM-H2DCFDA和DAF-FM試劑盒測量細胞內ROS和NO含量變化,發(fā)現(xiàn)LLL降低LPS誘導MSC中IL-1β,IL-6,IL-8,ROS和NO的分泌。免疫熒光檢測NF-κ B在LLL照射的MSC中核易位相對于LPS誘導組顯著下降。Western blot分析表明,LLL通過調節(jié)p65和Iκ Bα的磷酸化抑制NF-κ B的活化。我們將純化的外周血單核細胞(PBMC)通過植物凝集素(PHA)刺激后與3種方式處理的MSCs共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),LLL處理后的MSC顯著降低淋巴細胞激活標記CD25和CD69在PHA刺激的淋巴細胞上的表達。綜上所述,我們使用11-16 J/cm2劑量的LLL促進MSCs的增殖,遷移和抗凋亡能力以及加強其抑炎作用。LLL可以作為MSC在移植前預處理手段,以達到基于干細胞治療的安全和長期功效。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R329.2

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