本文關(guān)鍵詞：衰老相關(guān)ATG5缺陷致中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成障礙　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景:中性粒細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的前沿防線。除經(jīng)典的趨化、調(diào)理、吞噬和清除作用外,中性粒細(xì)胞還存在著另一套極為重要的限制和殺滅病原體的方法,即中性粒細(xì)胞胞外陷阱NETs。NETs是一種復(fù)雜的三維網(wǎng)狀DNA結(jié)構(gòu),其上附著有多種具有殺傷病原體功能的組分。盡管對NETs形成機制、關(guān)鍵環(huán)節(jié)的研究有了很多突破,但對于還有哪些理化生物因素能夠誘導(dǎo)NETs,以及關(guān)鍵的機制、分子是否存在共性,仍沒有一個確切的答案。老年人群的疾病發(fā)生率和死亡率均遠(yuǎn)高于年輕人群,以感染相關(guān)疾病的情況最為突出,這與免疫衰老密切相關(guān),即衰老對免疫系統(tǒng)功能功能的影響。中性粒細(xì)胞作為固有免疫的重要組成部分,衰老使其趨化能力受損、對細(xì)菌的清除能力減弱、炎癥因子表達(dá)和抗凋亡活性改變。但其對NETs形成的影響證據(jù)不足、機制不清。如若衰老影響了中性粒細(xì)胞NETs形成和NETosis過程,那么是否還會影響另一種死亡形式,凋亡?衰老導(dǎo)致中性粒細(xì)胞NETosis與凋亡的改變,其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是什么?本研究將著力解決上述三個問題。第一部分TLR2配體誘導(dǎo)ROS和自噬依賴的NETs形成目的:中性粒細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)的組分之一,其NETosis的過程及產(chǎn)物NETs,在機體抵抗病原體感染的過程中發(fā)揮著重要的作用。已經(jīng)明確多種物質(zhì)均可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs,對于機體感染/抗感染、炎癥反應(yīng)/抗炎反應(yīng)過程中的其他分子,能否刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs仍不清楚。本部分研究假設(shè)一:Toll樣受體2(TLR2)配體能夠有效誘導(dǎo)NETs形成。假設(shè)二:TLR2配體誘導(dǎo)的NETs形成為活性氧產(chǎn)物ROS依賴的。假設(shè)三:自噬過程同樣參與了TLR2配體誘導(dǎo)的NETs形成。方法:實驗一:為明確TLR2配體能否誘導(dǎo)NETs形成,提取的野生型WT小鼠原代腹腔中性粒細(xì)胞,體外經(jīng)肽聚糖PGN刺激6 h后,confocal下觀察NETs形成。同時選擇具有代表性的其他TLR2配體:LM、LTA、Pam3CSK4、Pam2CSK4、zymosan,confocal觀察驗證體外誘導(dǎo)NETs形成的能力。進(jìn)一步以6種TLR2配體刺激中性粒細(xì)胞2、3、6 h,采用熒光定量法檢測NETs形成的強弱。實驗二:為明確TLR2和myd88在上述配體誘導(dǎo)nets形成中的作用,采用tlr2knock-out(ko)小鼠和myd88ko小鼠的中性粒細(xì)胞,體外給予pgn刺激6h,經(jīng)confocal觀察nets形成。進(jìn)一步采用熒光定量法分析上述6種配體體外誘導(dǎo)的wt、tlr2ko和myd88ko小鼠中性粒細(xì)胞nets形成是否存在差異。實驗三:為明確tlr2配體與tlr4配體在誘導(dǎo)nets上是否存在協(xié)同效應(yīng),采用極小劑量的lps或pgn體外刺激中性粒細(xì)胞6h后經(jīng)confocal觀察。為進(jìn)一步驗證,采用熒光定量法進(jìn)行檢測。實驗四:為明確nadph氧化酶依賴的ros產(chǎn)生是否為tlr2誘導(dǎo)的nets形成所必需,采用gp91ko小鼠進(jìn)行實驗。首先用流式細(xì)胞術(shù)檢測gp91ko和wt小鼠中性粒細(xì)胞胞內(nèi)ros的基礎(chǔ)和pgn刺激后水平。進(jìn)而使用定量檢測分析比較gp91ko和wt小鼠中性粒細(xì)胞tlr2配體誘導(dǎo)的nets形成。進(jìn)一步經(jīng)confocal觀察tlr2配體刺激的gp91ko小鼠中性粒細(xì)胞。實驗五:為明確自噬過程是否參與tlr2配體誘導(dǎo)的nets形成,同時給予雷帕霉素和pgn6h同單獨給予pgn后經(jīng)confocal觀察nets形成。結(jié)果:實驗一:與對照相比,pgn能夠誘導(dǎo)典型的nets結(jié)構(gòu)。同時,選擇的另外5種tlr2配體也均能夠刺激中性粒細(xì)胞形成nets。相比于對照組,6種配體均可顯著提高培養(yǎng)上清液的熒光強度,提示nets的形成增加。實驗二:經(jīng)confocal觀察,pgn不能顯著誘導(dǎo)tlr2ko和myd88ko小鼠中性粒細(xì)胞的nets形成。定量分析tlr2ko和myd88ko小鼠中性粒細(xì)胞的nets形成均低于wt型小鼠。實驗三:極小劑量lps和pgn均不能顯著誘導(dǎo)nets形成,而兩者聯(lián)合應(yīng)用則可以明顯增加nets形成。定量分析得到類似的結(jié)果。實驗四:gp91ko小鼠中性粒細(xì)胞胞內(nèi)ros的基礎(chǔ)與wt小鼠無差異,在pgn刺激后則低于wt小鼠。多種tlr2配體刺激誘導(dǎo)的nets形成均低于wt小鼠中性粒細(xì)胞。confocal觀察處理6h后也均未見顯著的nets形成。實驗五:confocal觀察并計數(shù)結(jié)果表明pgn加入雷帕霉素相比于單獨使用pgn,進(jìn)一步提高了nets的生成。結(jié)論:多種tlr2配體可以有效誘導(dǎo)nets形成;tlr2-myd88通路為該過程所必需;tlr2配體和tlr4配體在誘導(dǎo)nets形成上具有協(xié)同效應(yīng);nadph氧化酶產(chǎn)生的ros為tlr2配體誘導(dǎo)的nets形成所必需;且自噬也參與該過程。第二部分老年小鼠中性粒細(xì)胞nets形成障礙及其機制目的:免疫衰老,即衰老引起的免疫系統(tǒng)功能減退,影響著固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的方方面面。中性粒細(xì)胞功能的改變直接影響著老年個體對病原體的防御能力。衰老使得中性粒細(xì)胞趨化能力受損、對病原體的吞噬及清除能力降低、ros的產(chǎn)生受到影響、抗凋亡能力發(fā)生改變、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常等。但對于老年個體nets形成的影響證據(jù)較少,機制不清。本部分研究假設(shè)一:老年小鼠中性粒細(xì)胞nets形成存在障礙,弱于年輕小鼠。假設(shè)二:老年和年輕小鼠中性粒細(xì)胞自噬活性的差異是nets形成障礙的原因。假設(shè)三:atg5是老年小鼠中性粒細(xì)胞tlr信號誘導(dǎo)的自噬活性缺陷的關(guān)鍵分子。假設(shè)四:老年小鼠中性粒細(xì)胞nets形成障礙還存在其他機制,如趨化能力減弱,ros產(chǎn)生減少。方法:實驗一:為明確老年和年輕小鼠中性粒細(xì)胞體內(nèi)nets形成能力是否存在差異,取年輕和老年小鼠構(gòu)建盲腸結(jié)扎穿刺clp模型,獲取6h后腹腔灌洗液,采用confocal觀察其中nets形成的情況。進(jìn)一步采用熒光定量法分析兩種小鼠clp后腹腔灌洗液中的nets含量。實驗二:為明確老年和年輕小鼠趨化能力差異對nets形成的影響,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測clp模型6h后腹腔募集的中性粒細(xì)胞比例。為排除衰老后骨髓中性粒細(xì)胞生成能力對募集到腹腔的中性粒細(xì)胞比例的影響,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測老年和年輕小鼠骨髓中性粒細(xì)胞的比例。實驗三:提取老年小鼠腹腔中性粒細(xì)胞,在體外用第一部分研究所述6種tlr2配體刺激6h后經(jīng)confocal觀察。進(jìn)一步采用熒光定量法對比年輕和老年小鼠nets形成能力的差異。為明確除tlr2配體外其他刺激下老年小鼠中性粒細(xì)胞nets形成是否也存在障礙,體外給予lps刺激6h后經(jīng)confocal觀察并一步用定量分析證實。實驗四:為明確中性粒細(xì)胞表面tlr2數(shù)量是否影響老年小鼠nets形成,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測pgn刺激前后老年和年輕小鼠中性粒細(xì)胞膜表面tlr2數(shù)量。進(jìn)一步檢測tlr2配體誘導(dǎo)的ros產(chǎn)生是否有差異。實驗五:為明確年輕和老年小鼠中性粒細(xì)胞在tlr2配體刺激后自噬活性是否存在差異,采用westernblot檢測基礎(chǔ)水平和pgn刺激2、4、6h后中性粒細(xì)胞中l(wèi)c3b的蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步證實低自噬活性參與了老年小鼠中性粒細(xì)胞nets形成障礙,體外pgn刺激的同時,給予雷帕霉素以提高自噬活性,驗證其能否改善老年組nets形成。實驗六:分析公開發(fā)表的高通量轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)據(jù),尋找老年組和年輕組間自噬相關(guān)的差異表達(dá)基因。進(jìn)一步采用westernblot驗證差異基因的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:實驗一:老年小鼠clp6h后腹腔灌洗液中nets形成明顯少于年輕小鼠。定量分析的結(jié)果類似。實驗二:老年小鼠clp6h后腹腔灌洗液中cd11b+ly6g+細(xì)胞群比例低于年輕小鼠。而老年和年輕小鼠骨髓中性粒細(xì)胞群的比例無差異。實驗三:老年中性粒細(xì)胞在tlr2配體刺激下均不能有效形成nets,熒光定量分析表明老年組nets形成明顯低于年輕組。相比于年輕小鼠,lps刺激的老年組nets形成也存在障礙,定量分析得到類似結(jié)果。實驗四:老年和年輕小鼠中性粒細(xì)胞膜表面tlr2數(shù)量在靜息狀態(tài)下和pgn刺激后無明顯差異。而6種tlr2配體體外刺激老年小鼠中性粒細(xì)胞3h誘導(dǎo)的胞內(nèi)ros產(chǎn)量均低于年輕小鼠。實驗五:年輕和老年小鼠的lc3b表達(dá)在pgn刺激后逐漸升高,在所有時間點,老年組的蛋白表達(dá)水平均低于年輕組。體外同時給予pgn和雷帕霉素,老年小鼠中性粒細(xì)胞的nets形成能力得到了一定程度的恢復(fù)。實驗六:高通量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)ulk1、atg13和atg5的轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在差異。westernblot結(jié)果表明各個時間點老年組atg5的蛋白表達(dá)水平均低于相應(yīng)的年輕組,而ulk1、atg13的表達(dá)差異不明顯,此外,老年組mtor的表達(dá)水平略高于年輕組。結(jié)論:在體和體外多種tlr配體的刺激下,老年小鼠中性粒細(xì)胞nets形成弱于年輕小鼠。刺激后自噬活性低可能是原因之一。atg5是老年小鼠中性粒細(xì)胞tlr信號誘導(dǎo)自噬活性缺陷的關(guān)鍵分子。還可能存在別的影響老年小鼠nets形成的因素,包括趨化能力、ros產(chǎn)量和mtor活性。第三部分老年小鼠中性粒細(xì)胞自噬缺陷致凋亡活性改變目的:正常情況下,靜息狀況的中性粒細(xì)胞會發(fā)生自發(fā)性凋亡;而活化的中性粒細(xì)胞除凋亡外還可以走向netosis。老年小鼠中性粒細(xì)胞的nets形成能力減弱,那么細(xì)胞凋亡水平在老年個體上是否也發(fā)生改變?是否受同一細(xì)胞過程的調(diào)控?本部分研究假設(shè)一:在tlr2配體刺激下,老年小鼠中性粒細(xì)胞更傾向于凋亡。假設(shè)二:老年和年輕小鼠在凋亡和netosis水平上的差異均受自噬活性的調(diào)控。方法:實驗一:為明確老年和年輕小鼠在TLR2配體刺激下凋亡活性是否存在差異,將老年和年輕小鼠的腹腔中性粒細(xì)胞體外給予PGN刺激6、12 h,采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡比例。實驗二:為明確TLR2信號誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞凋亡是否受自噬調(diào)控,年輕小鼠中性粒細(xì)胞體外PGN刺激的同時,給予自噬抑制劑wortmannin或balfilomycin A1,觀察凋亡比例的變化。在老年細(xì)胞上重復(fù)該實驗。進(jìn)一步在年輕和老年小鼠中性粒上給予PGN和自噬增強劑,觀察凋亡變化。實驗三:在年輕小鼠細(xì)胞上應(yīng)用PGN和自噬抑制劑,經(jīng)confocal同時觀察凋亡和NETosis水平,檢驗自噬同時調(diào)控凋亡和NETosis的假說。結(jié)果:實驗一:靜息6 h和PGN刺激6/12 h后,老年組的中性粒細(xì)胞凋亡比例均高于年輕組。實驗二:同時給予PGN和wortmannin或balfilomycin A1相比于單純給予PGN進(jìn)一步提高了凋亡細(xì)胞的比例,老年細(xì)胞的結(jié)果類似。而自噬增強劑能夠減少凋亡比例。實驗三:給予PGN和兩種自噬抑制劑后,細(xì)胞NETosis減少,凋亡明顯增加。結(jié)論:老年小鼠中性粒細(xì)胞在TLR2配體刺激下更傾向于凋亡,而非NETosis。中性粒細(xì)胞的自噬過程同時調(diào)控了NETosis和凋亡,老年組低自噬活性導(dǎo)致其NETs形成障礙,更易發(fā)生凋亡。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R339.38

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本文編號：1327798