本文關(guān)鍵詞：單細(xì)胞中生物小分子的快速分析研究　出處：《南京大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：細(xì)胞分析是分析化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)之間相互滲透而發(fā)展形成的跨學(xué)科前沿領(lǐng)域。隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展,研究者發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基或者機體中的同種細(xì)胞存在多樣性,或者說是異質(zhì)性,因此傳統(tǒng)在細(xì)胞群體上獲得的“平均值”信息已經(jīng)不能滿足我們的需要。鑒于單細(xì)胞分析可以更加準(zhǔn)確和全面地獲得細(xì)胞生理狀態(tài)和過程的重要信息,開展單細(xì)胞層面的高內(nèi)涵研究勢在必行。其中利用光學(xué)成像技術(shù)可以實現(xiàn)單細(xì)胞的高通量分析,并且還可以結(jié)合其他各種技術(shù)實現(xiàn)單細(xì)胞的全面、動態(tài)、可視的分析監(jiān)測,已經(jīng)成為當(dāng)前單細(xì)胞分析領(lǐng)域的一個研究熱點,越來越多的研究者致力于開發(fā)新的單細(xì)胞成像技術(shù)和新的用于成像的材料和探針。本論文就是圍繞開發(fā)新型的、快速的單細(xì)胞光學(xué)分析技術(shù)和新型的光學(xué)探針及其細(xì)胞成像應(yīng)用展開研究工作,實現(xiàn)了單細(xì)胞內(nèi)生物小分子的快速分析檢測。主要研究成果包括：1.基于電致化學(xué)發(fā)光成像對單細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的快速分析檢測基于魯米諾-H2O2體系的電致化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence,簡稱ECL)現(xiàn)象,結(jié)合我們課題組自己搭建的電致化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),首次實現(xiàn)了單細(xì)胞內(nèi)生物小分子(葡萄糖)的成像分析檢測。利用微加工技術(shù)制備細(xì)胞大小的ITO微孔陣列電極,在微孔電極上沉積金納米顆粒(Au NPs)放大ECL信號,用以實現(xiàn)低濃度H2O2的可視化檢測。經(jīng)過條件優(yōu)化后,ECL成像系統(tǒng)可以對濃度低至5μM的H2O2進(jìn)行成像分析。在此基礎(chǔ)上,利用Triton X-100破壞細(xì)胞膜,釋放單個細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖到微孔中和微孔內(nèi)的葡萄糖氧化酶反應(yīng)生成H2O2。產(chǎn)生的H2O2與溶液中魯米諾的衍生物(L012)反應(yīng),在施加的正電壓下產(chǎn)生光信號。來自64個微孔/細(xì)胞的光信號在60s內(nèi)由電感耦合裝置(CCD)進(jìn)行采集,從而通過成像實現(xiàn)了64個單細(xì)胞的平行快速分析。結(jié)果表明,在加入TritonX-100和葡萄糖氧化酶后,所有微孔中都能檢測到更高強度的化學(xué)發(fā)光,這表明通過ECL成像可以成功檢測單個細(xì)胞內(nèi)葡萄糖。為了驗證方法的可靠性,實驗測試了含有更少胞內(nèi)葡萄糖的“饑餓”細(xì)胞。較少的光強被檢測到,證實了魯米諾發(fā)光強度與細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的濃度有關(guān)。同時,來自同種細(xì)胞較大的光強差異,表明單個細(xì)胞中的葡萄糖濃度存在較大的偏差,從而首次揭示了細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的高度異質(zhì)性。這種新發(fā)明的電化學(xué)發(fā)光測定方法將有可能被應(yīng)用于對單細(xì)胞中更多的生物分子進(jìn)行快速分析,以闡明細(xì)胞間的異質(zhì)性。2.基于g-C3N4修飾微孔陣列電極增強電致化學(xué)發(fā)光對單細(xì)胞中膽固醇的全分析基于g-C3N4對魯米諾-H202體系的電致化學(xué)發(fā)光(ECL)的增強作用,我們利用g-C3N4納米片對微孔陣列電極進(jìn)行修飾,得到對H202更高的檢測靈敏度(500nM),實現(xiàn)了利用電致化學(xué)發(fā)光成像對單個細(xì)胞膜膽固醇和細(xì)胞內(nèi)膽固醇的同時分析。為了實現(xiàn)單細(xì)胞中膽固醇的分析,首先在負(fù)載有單個細(xì)胞的微孔陣列引入能夠產(chǎn)生H202的膽固醇氧化酶,用于膜膽固醇的發(fā)光分析;然后再用TritonX-100,膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶處理,使得細(xì)胞內(nèi)的膽固醇產(chǎn)生的H202可以進(jìn)行發(fā)光檢測。在這兩個步驟中均觀察到微孔中產(chǎn)生的發(fā)光光斑,證實了單個細(xì)胞的膜和細(xì)胞內(nèi)膽固醇的共同檢測。對細(xì)胞內(nèi)酰基輔酶A／膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)的抑制導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇儲存減少(較少發(fā)光)和膜膽固醇增加(更多的發(fā)光)。發(fā)光強度與膽固醇量的相關(guān)性證實了我們的方法可以同時檢測不同的細(xì)胞狀態(tài)下細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)膽固醇,有可能為單細(xì)胞膽固醇相關(guān)通路的研究方面提供更多的信息。3.基于aza-bodipy的近紅外熒光探針雙波長檢測細(xì)胞內(nèi)過氧化氫實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫在近紅外區(qū)域的熒光成像檢測對于實現(xiàn)活體熒光分析具有重要的意義,但目前探針的激發(fā)／發(fā)射波長多集中于可見區(qū)。我們基于aza-bodipy系列熒光探針熒光強度高,光穩(wěn)定性好,發(fā)射帶寬窄,發(fā)射波長在近紅外范圍的優(yōu)勢,以aza-bodipy作為母核,設(shè)計合成了硼酸官能團修飾的氮雜-硼二吡咯亞甲基染料(azaBDPBA),吸電子基團硼酸與H202發(fā)生反應(yīng)形成富電子的苯酚基團,其發(fā)射波長會發(fā)生紅移。由于細(xì)胞在近紅外區(qū)域自身發(fā)射的熒光背景干擾小,而且azaBDPBA對H202有很好的選擇性,不受細(xì)胞內(nèi)其它活性氧的干擾,將制備的azaBDPBA負(fù)載進(jìn)入細(xì)胞,通過熒光譜圖上呈現(xiàn)的雙波長熒光的變化指示生物過程中細(xì)胞內(nèi)H202的改變。利用該熒光探針與H202反應(yīng)前后得到的比例光譜,首次實現(xiàn)了對細(xì)胞內(nèi)H2O2具有高選擇性的近紅外區(qū)域雙波長熒光成像檢測。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q2-33

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本文編號：1327024