發(fā)布時(shí)間：2017-12-21 22:12

  本文關(guān)鍵詞：楊樹PtoVNS11和PtoMYB156轉(zhuǎn)錄因子在次生壁形成及類黃酮代謝途徑中的功能分析　出處：《西南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：苯丙烷代謝途徑是植物次生代謝產(chǎn)物合成中一條重要的生化途徑,該途徑以苯丙氨酸(Phenylalanine)和酪氨酸(Tyrosine)為底物,在苯丙氨酸裂解酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、肉桂酸-4羥化酶(Cinnamate-4-hydroxylase,C4H)等催化下,通過下游特異性分支途徑,分別合成木質(zhì)素、花青素、丹寧等次生代謝產(chǎn)物。這些次生代謝化合物在植物生長發(fā)育、抵御生物或非生物脅迫中起著重要的作用。比如,木質(zhì)素作為細(xì)胞壁的重要組分,為植物提供機(jī)械支撐,并參與病害的防御;而花青素和丹寧等類黃酮化合物則在植物細(xì)胞抵御外來非生物脅迫(如紫外輻射)和生物脅迫(如抗病蟲害)中扮演了重要角色。在草本植物中,已經(jīng)證實(shí)苯丙烷代謝途徑受到了NAC、MYB等許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,而該途徑在木本植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究還相對較少,因此,解析林木中苯丙烷代謝途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制對于闡明木質(zhì)素及類黃酮等次生代謝產(chǎn)物合成代謝調(diào)控機(jī)理具有十分重要的意義。本文以楊樹為研究對象,分別克隆了NAC和MYB家族轉(zhuǎn)錄因子Pto VNS11和PtoMYB156,對其在調(diào)控楊樹次生壁合成和苯丙烷代謝途徑中的生物學(xué)功能進(jìn)行了系統(tǒng)研究,主要結(jié)果如下:(一)從毛白楊(Populus tomentosa Carr.)中克隆到一個(gè)與擬南芥SND1高度同源的NAC家族轉(zhuǎn)錄因子編碼基因PtoVNS11。該基因編碼一個(gè)由416個(gè)氨基酸組成的蛋白,具有NAC家族轉(zhuǎn)錄因子保守的功能結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析顯示,該蛋白與擬南芥和毛果楊中調(diào)控次生壁合成調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SND1和PtrWND1B的序列相似性分別達(dá)59.6%和97.9%,而在NAC家族轉(zhuǎn)錄因子特有結(jié)構(gòu)域(A~E結(jié)構(gòu)域)中的氨基酸序列基本一致。推測PtoVNS11為SND1、PtrWND1B的同源基因,可能具有相似的生物學(xué)功能。實(shí)時(shí)定量PCR分析PtoVNS11基因組織表達(dá)譜發(fā)現(xiàn),該基因在楊樹莖的木質(zhì)部中特異性表達(dá),暗示其可能參與了對植物次生壁形成的調(diào)控。進(jìn)一步將ptovns11融合gfp構(gòu)建重組蛋白,亞細(xì)胞定位試驗(yàn)證明,ptovns11專一定位于細(xì)胞核中。酵母轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)表明,ptovns11具有轉(zhuǎn)錄激活特性。同時(shí),克隆ptovns11基因上游2069bp的啟動子片段,融合gus報(bào)告基因,在轉(zhuǎn)基因擬南芥中證實(shí),該啟動子能在營養(yǎng)及繁殖器官的維管組織中表達(dá),且啟動子內(nèi)的snbe(secondarywallnacbindingelement)元件決定了gus基因的表達(dá)活性,暗示ptovns11可能調(diào)控了楊樹維管組織的發(fā)育。為了搞清ptovns11的生物學(xué)功能,將其構(gòu)建到由組成型表達(dá)啟動子驅(qū)動的植物表達(dá)載體上,首先導(dǎo)入擬南芥snd1nst1雙突變體中,發(fā)現(xiàn)該基因可恢復(fù)雙突變體維管束間纖維及木質(zhì)纖維形成受阻、莖桿倒伏等缺陷。在擬南芥中過量表達(dá)該基因,則引起了木質(zhì)部細(xì)胞和表皮細(xì)胞次生壁的異位形成和木質(zhì)素的過量沉積。上述結(jié)果與擬南芥snd1、nst1及ptrwnds基因的功能相似,證明ptovns11是楊樹次生壁形成中木質(zhì)素合成的“開關(guān)”基因。進(jìn)一步在楊樹中過量表達(dá)ptovns11,導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株莖中木質(zhì)素含量增加。定量pcr分析顯示,該基因的超表達(dá)激活了轉(zhuǎn)基因楊樹中一系列與次生壁合成相關(guān)的nac/myb轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。(二)在超表達(dá)ptovns11的轉(zhuǎn)基因楊樹中,ptomyb156的表達(dá)水平被明顯下調(diào),進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)ptomyb156與擬南芥myb4高度同源,而后者已被證實(shí)作為轉(zhuǎn)錄抑制子參與了擬南芥中木質(zhì)素合成的調(diào)控。因此,推測楊樹中的ptomyb156是位于ptovns11下游的負(fù)調(diào)控因子,可能參與了楊樹次生壁的生物合成過程。為了解析ptomyb156轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能,從毛白楊(p.tomentosacarr.)中克隆了該基因。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)證明ptomyb156定位于細(xì)胞核中。啟動子表達(dá)特性和實(shí)時(shí)定量pcr分析顯示,ptomyb156不僅在毛白楊的莖、根、木質(zhì)部和莖皮等表達(dá)水平較高,而且在葉片及葉柄等組織中含量也比較豐富。酵母單雜交試驗(yàn)證實(shí)ptomyb156具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。為了進(jìn)一步研究ptomyb156的生物學(xué)功能,構(gòu)建了35s:ptomyb156超表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化,獲得毛白楊轉(zhuǎn)基因超表達(dá)株系。利用crispr/cas9靶向基因編輯技術(shù),特異的敲除了毛白楊內(nèi)源的ptomby156編碼基因,獲得了該基因功能缺失的突變體株系。觀察發(fā)現(xiàn)ptomyb156過量表達(dá)引起楊樹倒伏、葉片皺縮上卷,轉(zhuǎn)基因楊樹莖的直徑、成熟葉葉面積及植株總生物量等相關(guān)生長指標(biāo)下降。在分子水平上,多個(gè)次生壁形成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因表達(dá)下調(diào)。而敲除該基因則導(dǎo)致木質(zhì)部導(dǎo)管和纖維細(xì)胞次生壁厚度增加。同時(shí)引起木質(zhì)素合成鍵酶基因表達(dá)顯著上升。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明ptomyb156基因參與了楊樹木質(zhì)素生物合成途徑的調(diào)控,進(jìn)而影響了楊樹次生壁的形成和次生木質(zhì)部的發(fā)育。(三)為了闡明ptomyb156是否參與了楊樹類黃酮合成途徑中的調(diào)控,對ptomyb156轉(zhuǎn)基因楊樹中類黃酮合成途徑中關(guān)鍵美的表達(dá)進(jìn)行了分子檢測,發(fā)現(xiàn)C4H,CHS,DFR等關(guān)鍵酶編碼基因的表達(dá)被下調(diào),暗示PtoMYB156可能負(fù)調(diào)控楊樹中花青素、丹寧等類黃酮化合物的合成。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PtoMYB156的功能,將其在擬南芥中過量表達(dá),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株子葉卷曲、體型變小、種子種皮顏色呈淺黃色等表型。DMACA染色顯示轉(zhuǎn)基因種子中丹寧含量明顯減少。UV-B輻射的抵抗試驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抵御能力減弱。HPLC檢測顯示兩種類黃酮化合物——槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)和可溶性丹寧含量均明顯下降。定量PCR分析顯示參與單寧、槲皮素和山奈酚合成的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量均有下調(diào)。煙草葉片瞬時(shí)共表達(dá)試驗(yàn)證明,PtoMYB156能抑制類黃酮合成途徑關(guān)鍵酶LAR、FLS及次生壁合成途徑中相關(guān)基因C4H、CesA17、GT43B的表達(dá)。上述結(jié)果表明,PtoMYB156通過調(diào)節(jié)類黃酮化合物的含量,降低了植物對UV-B輻射脅迫的防御能力,影響了擬南芥種皮中色素的累積。綜上所述,本論文克隆了兩個(gè)參與楊樹次生壁發(fā)育及類黃酮合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子PtoVNS11和Pto MYB156,并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除技術(shù)及組織化學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法,闡明了其對楊樹木質(zhì)部次生壁形成的調(diào)控及對UV輻射脅迫響應(yīng)能力的影響,揭示了兩者參與調(diào)控苯丙烷代謝途徑中多種次生代謝產(chǎn)物合成的分子機(jī)制,為楊樹遺傳改良奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
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本文編號：1317349