本文關(guān)鍵詞：擬南芥液泡磷轉(zhuǎn)運(yùn)體的分子鑒定及其功能研究　出處：《南京大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：磷是植物生長發(fā)育所必需的大量元素,然而土壤中有效磷濃度往往很低,這常常成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的限制因素。因此,在實(shí)際生產(chǎn)中往往會通過施加大量的磷來提高作物的產(chǎn)量。但是,磷屬不可再生資源,依現(xiàn)在的速度在不久的將來將會開發(fā)殆盡,而且,大量施加磷也會引起水體富營養(yǎng)化等環(huán)境問題。如何提高植物的磷素利用效率已是一個迫在眉睫的問題。充分了解植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和累積無機(jī)磷(Pi)的機(jī)制是提高植物磷素利用效率的基本前提。目前已知質(zhì)膜定位的PHT1家族成員主要負(fù)責(zé)Pi的吸收,高爾基體定位的PHO1主要負(fù)責(zé)將Pi向木質(zhì)部中裝載以進(jìn)行長距離運(yùn)輸,線粒體和葉綠體定位的Pi轉(zhuǎn)運(yùn)體也均有被發(fā)現(xiàn)。植物中大部分Pi都儲存于液泡中,這對于維持細(xì)胞的磷素平衡至關(guān)重要,然而,負(fù)責(zé)液泡Pi儲存的轉(zhuǎn)運(yùn)體還完全不清楚。由于砷酸鹽[As(V)]與Pi具有極為相似的物理化學(xué)性質(zhì),它可競爭性地與Pi轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合而進(jìn)入植物體內(nèi),危害人類健康。目前,砷污染已成為一個嚴(yán)重的全球性問題,如何減少砷在作物體內(nèi)累積也是一個亟待解決的重要課題。已有大量的研究顯示質(zhì)膜上的PHT1家族成員介導(dǎo)了As(V)進(jìn)入植物體內(nèi),然而,內(nèi)膜系統(tǒng)上的Pi轉(zhuǎn)運(yùn)體在改變Pi平衡的同時,是否對As(V)的吸收也有重要影響還并不清楚。本論文利用生物信息學(xué)、植物分子遺傳學(xué)、熒光蛋白分子定位和膜片鉗技術(shù)等方法,首次發(fā)現(xiàn)位于擬南芥液泡膜上的一個負(fù)責(zé)磷儲存的轉(zhuǎn)運(yùn)體,并將其命名為VPT1 (Vacuolar Phosphate Transporter 1)。進(jìn)一步,我們通過基因敲除突變體、過表達(dá)植株和瞬時誘導(dǎo)表達(dá)體系等方法,首次發(fā)現(xiàn)定位于內(nèi)膜系統(tǒng)上的VPT1對植物的耐砷性及砷吸收和累積的也有重要影響,并從對PHT1家族成員的反饋表達(dá)調(diào)控方面做出了解釋。我們獲得的主要結(jié)果如下：1.挖掘到進(jìn)化高度保守的SPX-MFS家族成員VPT 1是擬南芥適應(yīng)各種Pi環(huán)境的關(guān)鍵組分�？紤]到磷是各種生物體生長發(fā)育所必需的元素,轉(zhuǎn)運(yùn)Pi的相關(guān)蛋白具有進(jìn)化保守性,因此,利用生物信息學(xué)預(yù)測和擬南芥突變體庫篩選,并結(jié)合生長表型分析,篩選到控制擬南芥適應(yīng)各種Pi環(huán)境的關(guān)鍵基因VPT1。A.預(yù)測到擬南芥中三個具有12個跨膜結(jié)構(gòu)SPX-MFS家族成員可能為液泡膜上的磷素轉(zhuǎn)運(yùn)體。通過與酵母液泡磷轉(zhuǎn)運(yùn)體ScVTCs和ScPH091的親緣關(guān)系分析來看,我們推測擬南芥SPX-MFS家族蛋白可能是液泡磷轉(zhuǎn)運(yùn)體。B.擬南芥SPX-MFS家族成員VPT1突變體在土培條件下出現(xiàn)生長異常的表型。我們首先篩選到了Atlg63010 (VPT1)和At4g22990的T-DNA插入敲除突變體。在正常土培條件下,我們發(fā)現(xiàn)vptl突變體生長矮小,而且出現(xiàn)早花的現(xiàn)象,于是它被選定為隨后的研究材料。進(jìn)一步,我們通過VPT1的全長基因成功回補(bǔ)了vptl突變體的表型。C. vptl突變體對高低磷的適應(yīng)都出現(xiàn)嚴(yán)重的缺陷。我們首先在水培條件下進(jìn)行了磷梯度實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)突變體vptl對高磷非常敏感。然后在1/2 MS瓊脂培養(yǎng)基上同樣得到了類似的表型。當(dāng)從磷充分的水培條件下移栽至磷缺乏條件下后,突變體vptl的缺磷癥狀較野生型更為嚴(yán)重,相應(yīng)地,累積了更多的花青素。2.VPT1為植物對Pi的累積和分配所必需。為了鑒定VPT1的分子功能,我們首先對vptl突變體內(nèi)的Pi含量進(jìn)行了測定,然后根據(jù)VPT1的基因表達(dá)模式,分析了VPT1在擬南芥對磷素適應(yīng)中的作用。A.突變體vptl體內(nèi)Pi含量一直維持在一個較低的水平。在我們的磷梯度實(shí)驗(yàn)中,除了在極低的磷條件下突變體vptl的Pi含量與野生型沒有明顯差異以外,其它磷濃度條件下突變體vptl的Pi含量均較野生型更低,尤其是在高磷條件差異更為明顯。當(dāng)向水培液中施加更高的Pi濃度,野生型能夠?qū)i進(jìn)行有效累積,然而,突變體卻不能。B.VPT1優(yōu)先在幼嫩組織中表達(dá),并且通過在老葉中的強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)來解除高磷對嫩葉的毒害。我們通過對pVPT1::GUS轉(zhuǎn)基因植株的組織化學(xué)染色清楚地顯示,VPT1主要在幼嫩組織中表達(dá),如根尖和幼葉。與之對應(yīng)的是,幼葉中的Pi含量也較其它葉片中的要高一些。通過實(shí)時定量PCR分析發(fā)現(xiàn),VPT1在葉片和根中均受高磷誘導(dǎo)表達(dá),而在葉片中又以老葉為主。與之對應(yīng)的是,高磷引起的Pi累積也主要發(fā)生在較老的葉片當(dāng)中。3.確認(rèn)VPT1為定位于液泡膜上負(fù)責(zé)Pi吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)體。通過vptl突變體的高磷敏感和低磷含量的生理學(xué)特征,我們推測VPT1是一個負(fù)責(zé)液泡磷儲存的轉(zhuǎn)運(yùn)體。因此,我們對VPT1進(jìn)行了精確的亞細(xì)胞定位,并通過膜片鉗技術(shù)對VPT1的分子功能進(jìn)行了充分的驗(yàn)證。A.VPT1為定位于液泡膜上。首先我們通過激光共聚焦顯微鏡對表達(dá)有VPT1-GFP融合蛋白的轉(zhuǎn)基植株進(jìn)行了觀察,質(zhì)膜熒光染料FM4-64所發(fā)出的紅色熒光信號與VPT-GFP發(fā)出的綠色熒光信號完全不重疊。然后,我們對同時表達(dá)有VPT1-GFP和液泡膜標(biāo)記蛋白y-TIP-mCherry融合蛋白的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了觀察,發(fā)現(xiàn)它們的熒光信號完全重疊。最后,我們對表達(dá)有VPT1-GFP的葉肉細(xì)胞液泡進(jìn)行了分離,更為清楚地顯示了VPT1的確定位于液泡膜上。B.VPT1為液泡膜上負(fù)責(zé)Pi吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)體。我們通過膜片鉗技術(shù)對vptl突變體或者過表達(dá)有VPT1-GFP的煙草葉肉細(xì)胞的全液泡進(jìn)行了內(nèi)向磷電流記錄。結(jié)果分析顯示VPT1介導(dǎo)了很強(qiáng)的Pi內(nèi)向電流,并且具有明顯的細(xì)胞質(zhì)Pi濃度依賴性。離子選擇性分析發(fā)現(xiàn)VPT1還能轉(zhuǎn)運(yùn)SO42-、NO3-、Cl和蘋果酸,但它們都較Pi弱。進(jìn)一步,我們又對VPT1單通道性質(zhì)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)它的開放概率隨著液泡膜的跨膜電位的增加而增加。這些結(jié)果充分證實(shí)了VPT1為一個位于液泡膜上主要負(fù)責(zé)Pi吸收的重要的磷轉(zhuǎn)運(yùn)體。4.VPT1反饋調(diào)控著擬南芥對砷酸鹽的吸收和累積。VPT1的遺傳缺失會導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Pi不能有效地向液泡中轉(zhuǎn)運(yùn),因此,在磷充分條件下它很容易處于過量狀態(tài)。但是,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)較高的Pi水平不僅有利于拮抗As(V)的競爭性毒害作用,還能夠反饋抑制質(zhì)膜上的PHT1家族成員的表達(dá),從而降低植物對As(Ⅴ)的吸收。A.VPT1缺失以后會反饋抑制PHT1s家族基因的表達(dá)。在磷充分的條件下,vptl突變體中的兩個重要的質(zhì)膜Pi/As(V)轉(zhuǎn)運(yùn)體基因PHT1;1和PHT1;4的表達(dá)水平均較野生型中的低很多。相應(yīng)的,PHT1;1的轉(zhuǎn)錄抑制因子WRKY6和轉(zhuǎn)錄激活因子WRKY45的基因表達(dá)水平在vptl突變體中分別較野生型的更高和更低。B.VPT1影響著擬南芥的耐As(V)脅迫能力,但它依賴于環(huán)境中的磷濃度。與野生型相比,在磷充分的條件下突變體vptl表現(xiàn)出明顯的耐As(V)脅迫的表型,而VPT1過表達(dá)植株卻對As(V)肋迫更為敏感。然而,低磷條件下VPT1引起的這些As(V)敏感性變化幾乎完全消失。C.VPT1影響著擬南芥對As(V)的吸收和累積。在磷充分條件下,與野生型相比,短期As(V)處理后突變體vptl體內(nèi)累積更少的砷,而VPT1過表植株卻累積了更多的砷。長期的低濃度As(V)處理以后,突變體vptl的果莢中有更低的砷,但這在VPT1過表達(dá)植株果莢中卻完全相反。因此,液泡磷轉(zhuǎn)運(yùn)體VPT1不僅對植物的磷環(huán)境適應(yīng)性非常重要,而且對植物的砷酸鹽吸收也有重要的反饋調(diào)控作用。本研究不僅揭示了一個全新的轉(zhuǎn)運(yùn)體的生物學(xué)功能,還為磷素高效利用和低砷高品質(zhì)作物的分子育種提供了一個新的重要途徑。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943

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