本文關(guān)鍵詞：牛多殺性巴氏桿菌比較基因組學分析及保護性抗原的篩選　出處：《西南大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)是一種能夠引起禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、牛出血性敗血癥、牛肺炎等疫病的人畜共患性致病菌。根據(jù)菌體莢膜抗原的不同,可將其分為A、B、D、E和F5種莢膜血清型。以往在牛群中流行的主要是引起出血性敗血癥的莢膜血清B型,而近年來也分離到引起呼吸系統(tǒng)綜合癥為主的莢膜血清A型,該病已成為世界各地危害養(yǎng)牛業(yè)的主要疫病,給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。由于Pm的血清型比較多,異源或異型Pm交叉保護作用較低,給該病的防治帶來了較大困難。目前,國內(nèi)所用疫苗主要是針對牛出血性敗血癥的莢膜血清B型的傳統(tǒng)滅活疫苗,尚無針對A型的疫苗。因此,開展牛源Pm A型保護性抗原的篩選鑒定,對新型疫苗(尤其是對不同血清型具有交叉保護作用的疫苗)的研發(fā)具有重要的理論意義和實際意義。本課題組先后從發(fā)病肉牛群中分離鑒定到6株A型Pm(PmCQ1~PmCQ6)和1株F型Pm(Pm F),其中PmCQ1~PmCQ5為強毒株,PmCQ6為弱毒株。本研究利用第二代測序技術(shù)對PmCQ6和B型標準株P(guān)m B菌株(CVCC450)進行全基因組測序,并結(jié)合之前實驗室測序的PmCQ2和Pm F以及NCBI上公布的多個Pm全基因組序列,通過比較基因組學分析,揭示了不同菌株基因組結(jié)構(gòu)及功能基因的差異,為新毒力基因的挖掘及致病機制的研究提供分子基礎(chǔ)。然后通過生物信息學和免疫蛋白質(zhì)組學分析,篩選出Pm保護性抗原候選編碼基因,經(jīng)克隆表達及間接ELISA或蛋白免疫印跡分析候選抗原分子的反應原性,最后,經(jīng)動物攻毒保護性試驗評價候選分子的免疫保護效力,并篩選到多個保護性抗原,該研究為新型疫苗的研發(fā)提供了候選分子。本課題主要研究內(nèi)容如下:1.多殺性巴氏桿菌全基因組測序與組裝本研究將實驗室保存的不同血清型Pm菌株(Pm B、PmCQ2、PmCQ6和Pm F)經(jīng)體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),4株P(guān)m菌落大小存在明顯的差異,尤其A型PmCQ6菌株明顯小于Pm B、PmCQ2和Pm F菌株。通過小鼠和家兔致病性實驗發(fā)現(xiàn),4株菌株的致病性存在明顯的差異,B型Pm B為強毒株,而A型PmCQ6為弱毒株。通過對雛雞的致病性發(fā)現(xiàn),4株P(guān)m均不能引起雛雞的死亡。本實驗室前期已完成了牛源A型PmCQ2(強毒株)和牛源F型Pm F(弱毒株)的全基因組測序,為了更全面地分析牛源Pm的毒力基因差異和篩選交叉保護性抗原,我們使用第二代測序方法技術(shù)將獲得的牛源A型PmCQ6(弱毒株)和牛源B型Pm B(強毒株)進行全基因組測序,利用SOAPdenovo完成拼接組裝,并重新注釋4株P(guān)m基因組。通過4株P(guān)m基因組比較得出,4株P(guān)m基因組大小在2.2~2.3Mbp,預測ORF平均個數(shù)1977個,其GC含量約為39.1~40.39%,t RNA個數(shù)在43~50之間,均包含有16S-23S-5S r RNA元件。通過基因組信息圖的繪制、基因組的功能注釋和噬菌體相關(guān)基因的預測,我們得知4株P(guān)m基因組均存在一定的差異。2.多殺性巴氏桿菌比較基因組學分析本研究將測序的4株菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布的24株P(guān)m菌株根據(jù)core genes構(gòu)建進化樹,發(fā)現(xiàn)PmCQ2、PmCQ6和36950聚為一枝,Pm B與2213聚為一枝,Pm F與Pm70聚為一枝,我們選擇不同宿主(牛、豬、羊、禽)和不同血清型(A、B、D和F型)的10株不同毒力的Pm進行比較基因組學分析。通過全基因組共線性分析得知,Pm基因組共線性較好,基因組比較保守,但不同菌株會出現(xiàn)不同片段的插入。對插入序列的預測發(fā)現(xiàn),PmCQ2、36950和HN06菌株中都有大片段的插入序列,而Pm F株上未發(fā)現(xiàn)插入序列,推測強毒株與弱毒株毒力大小的差異可能存在于大片段轉(zhuǎn)座子的插入與缺失。通過差異基因的分析預測,我們篩選到不同血清型和不同宿主源的差異基因,可以為種型診斷靶標的篩選和宿主嗜性分析提供理論依據(jù)。通過基因組島、莢膜基因、脂多糖相關(guān)基因等毒力相關(guān)基因分析比較強弱毒株之間的差異,推測轉(zhuǎn)座酶、噬菌體整合相關(guān)基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因可能與強毒株與弱毒株或無毒株之間的毒力大小差異有關(guān)。通過與雙組分調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫P2CS數(shù)據(jù)庫比對,發(fā)現(xiàn)在Pm B和Pm F中有18個雙組分調(diào)節(jié)元件,在PmCQ2和PmCQ6中有16個雙組分調(diào)節(jié)元件,分屬于7類雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)。最后,通過生物信息學分析篩選到4株共有的膜蛋白有458個,共有的分泌蛋白有162個,該結(jié)果為后續(xù)新型疫苗候選分子的篩選奠定基礎(chǔ)。3.保護性抗原候選分子的篩選結(jié)合上一部分篩選的4株測序菌株共有的膜蛋白和分泌蛋白,經(jīng)Signal和TMMHM在線網(wǎng)站對分析結(jié)果進行進一步預測,最后篩選到48個候選抗原基因。通過Triton X-114方法提取4株P(guān)m的外膜蛋白,經(jīng)免疫蛋白質(zhì)組學分析,篩選到15個候選抗原基因。將以上兩種方法篩選得到的候選抗原基因,經(jīng)克隆表達,最終表達得到42個候選分子,純化后使用實驗室制備4種牛血清(PmCQ2人工感染血清、PmCQ2滅活苗免疫血清、Pm B人工感染血清和Pm F人工感染血清)經(jīng)間接ELISA對其反應原性進行分析,共篩選到27個具有較高反應原性的候選分子。其中篩選到與4種血清反應原性較高的有5個;與A、B、F型人工感染血清反應原性較高有1個;與A、B型人工感染血清反應原性較高的有10個;僅與A型人工感染血清反應原性較高的6個;僅與B型人工感染制備的血清反應較高有5個。為了確定攻毒的最佳途徑,我們首先將PmCQ2培養(yǎng)物分別通過滴鼻、腹腔和肌肉接種途徑感染小鼠后,觀察其存活情況、體內(nèi)定植以及病理變化,結(jié)果顯示三種途徑下PmCQ2均能夠定植于小鼠的肝、脾和肺等臟器中,且均能夠引起肺臟發(fā)生病理變化,導致小鼠死亡,該結(jié)果提示小鼠建模成功。但由于Pm B通過滴鼻方式不能引起小鼠死亡,因此我們選擇肌肉注射作為評價候選抗原分子保護性的最佳途徑。選擇反應原性較高的10個重組候選分子進行動物攻毒保護性試驗,分析其免疫保護效果。結(jié)果表明,經(jīng)r PmCQ2_1g0524和r PmCQ2_1g0311免疫后的小鼠均可以在一定程度上抵抗PmCQ2株的攻擊,其保護性為30%,對Pm B和Pm F無保護性;同時發(fā)現(xiàn)對PmCQ2、Pm B具有交叉保護作用的為r PmCQ2_1g0376和r PmCQ2_1g0327,其保護性分別為50%/30%和50%/40%;對PmCQ2,Pm B和Pm F具有交叉保護性作用的有r PmCQ2_4g0132和r PmCQ2_2g0128,其保護性分別為80%/20%/10%和50%/40%/30%;僅對Pm B和Pm F具有一定的保護性的抗原為r PmCQ2_2g0128,其Pm B和Pm F保護性是40%和30%。該研究首次篩選到牛源A型菌株中具有交叉保護作用的候選分子。4.PmCQ2_1g0327交叉保護性研究基于生物信息學分析發(fā)現(xiàn),PmCQ2_1g0327僅存在于A型Pm中,而PmCQ2_1g0376、PmCQ2_4g0132和PmCQ2_2g0128則在A、B、D和F型Pm中均存在。通過Pm全基因組序列的同源性分析和體外培養(yǎng)菌株的熒光定量PCR發(fā)現(xiàn),該基因僅存在于A型菌株,在弱毒株P(guān)mCQ6菌株中表達較低,且不存在于Pm B和Pm F中。通過DNAstar軟件和IEDB等線分析預測PmCQ2_1g0327存在的潛在的優(yōu)勢抗原表位序列,而且這些抗原表位多集中于該序列的N端。為了驗證其潛在的優(yōu)勢抗原表位,將PmCQ2_1g0327全長基因分別截取7個片段進行克隆表達純化,并通過間接ELISA分析反應原性,結(jié)果顯示包含TIDTAPKQNPVPT抗原表位的216-306bp與PmCQ2、Pm B人工感染的血清反應原性較高。經(jīng)動物保護性實驗驗證發(fā)現(xiàn),該肽段對PmCQ2和Pm B的保護性分別是40%和10%,值得注意的是274-695bp的肽段對Pm B具有一定的保護性,推斷該抗原表位能夠在保護宿主抵抗Pm B的攻擊中發(fā)揮主要作用。將r PmCQ2_1g0327蛋白序列和優(yōu)勢抗原表位序列與Pm B全基因組序列進行Blast分析,發(fā)現(xiàn)該序列與Pm B_1759g0022的同源性較高,將Pm B_1759g0022克隆表達,免疫小鼠后進行攻毒實驗發(fā)現(xiàn),r Pm B_1759g0022對Pm B的保護性為40%。由此推測該TIDTAPKQNPVPT抗原肽段在抵抗Pm B侵襲中起到關(guān)鍵作用。最后,純化可溶蛋白r PmCQ2_1g0327制備小鼠多克隆抗體,其抗體效價為1:102400。通過WB結(jié)果可知,r Pm B_1759g0022與r PmCQ2_1g0327的鼠多抗有較好的反應原性。通過IFA實驗結(jié)果表明,r PmCQ2_1g0327抗體能夠特異地識別PmCQ2細胞壁和細胞膜上的抗原,并與之發(fā)生免疫反應,提示該蛋白主要分布于PmCQ2的表面�？贵w封閉實驗結(jié)果顯示,r PmCQ2_1g0327在細菌黏附方面作用并不顯著。綜上所述,本研究我們結(jié)合生物信息學分析強弱毒株全基因,全面分析潛在的候選抗原分子,結(jié)合免疫蛋白質(zhì)組學分析初次篩選到4個交叉保護性候選抗原分子。其中A型特異基因PmCQ2_1g0327具有較高的交叉保護性,其中TIDTAPKQNPVPT的肽段能夠抵抗Pm B的侵染,在候選抗原的交叉保護作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由此,PmCQ2_1g0327可作為Pm新型疫苗的候選抗原分子。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61

【參考文獻】

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