本文關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌SQR9增強(qiáng)植物耐鹽能力的機(jī)制研究　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目前,世界上有20%的耕地受到鹽害的影響,過量的鹽分會(huì)影響作物生長(zhǎng),導(dǎo)致產(chǎn)量降低,嚴(yán)重限制農(nóng)作物的產(chǎn)出。鹽害除了會(huì)導(dǎo)致植物離子毒害和滲透脅迫,還會(huì)引起氧化傷害,因此有必要采取一些有效措施來增強(qiáng)植物的耐鹽能力,其中根際促生菌(PGPR)被認(rèn)為可以有效增強(qiáng)植物耐鹽脅迫能力。解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) SQR9是本實(shí)驗(yàn)室在健康黃瓜根際篩選到的一株根際促生菌,可以顯著地促進(jìn)黃瓜植物的生長(zhǎng)。以SQR9為添加菌劑的生物有機(jī)肥可以有效地促進(jìn)植物生長(zhǎng),抑制土傳病害的發(fā)生。本文發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌SQR9不僅對(duì)植物有促生作用,還可以顯著的增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫的耐受能力。通過研究接種SQR9對(duì)鹽脅迫下植物耐鹽相關(guān)生理指標(biāo)和基因轉(zhuǎn)錄的影響,初步確定SQR9誘導(dǎo)植物耐鹽脅迫的途徑。通過對(duì)SQR9誘導(dǎo)植物耐鹽脅迫的信號(hào)物質(zhì)的研究及擬南芥突變體驗(yàn)證,確定了 SQR9誘導(dǎo)植物耐鹽脅迫的主要途徑,并發(fā)現(xiàn)亞精胺為SQR9產(chǎn)生的誘導(dǎo)植物耐鹽的重要信號(hào)物質(zhì)。獲得如下主要結(jié)果:在水培和瓊脂培養(yǎng)條件下,解淀粉芽孢桿菌SQR9可以增強(qiáng)玉米、水稻和擬南芥三種作物在不同鹽濃度下的耐鹽能力。在100 mMNaCl下,接種SQR9的玉米的莖葉和根部鮮重分別是對(duì)照組玉米的2.69倍和1.78倍,接種SQR9的擬南芥的莖葉和根部鮮重分別是對(duì)照組的2.85倍和1.9倍,且接種SQR9導(dǎo)致植物根部側(cè)根的數(shù)量顯著增加。在鹽脅迫下,SQR9可以通過調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)來影響植物相關(guān)生理指標(biāo),如葉綠素、光合速率、脫落酸(ABA)、滲透調(diào)節(jié)物可溶性總糖(TSS)、抗氧化物酶、還原型谷胱甘肽(GSH)和Na+含量。RBCS和RBCL是植物光合作用關(guān)鍵基因,SQR9可以通過提高玉米內(nèi)的ZmRBCS、ZmRBCL基因和擬南芥內(nèi)AtRBCS、AtRBCL基因的轉(zhuǎn)錄水平來增強(qiáng)植物光合作用。同時(shí)在鹽脅迫下,SQR9接種的玉米葉綠素和類胡蘿卜素含量分別是未接種對(duì)照的1.84和1.44倍,而接種SQR9的擬南芥葉綠素和類胡蘿卜素分別是對(duì)照組的3.39倍和3.35倍,同時(shí)在鹽脅迫下SQR9的接種顯著增強(qiáng)了玉米和擬南芥的光合速率。在鹽害下,植物會(huì)通過提高ABA含量來調(diào)控氣孔減少水分的喪失,而在鹽脅迫下,接種SQR9分別降低了玉米和擬南芥內(nèi)ZmNCED和AtNCED3基因(ABA合成的關(guān)鍵基因)的轉(zhuǎn)錄水平,抑制了玉米和擬南芥中ABA含量的升高。接種SQR9將玉米和擬南芥TSS含量增加為對(duì)照的2.29倍和1.47倍。接種SQR9雖然顯著提高了玉米的過氧化物酶(POD)活性,但對(duì)擬南芥POD活性并沒有顯著的影響。接種SQR9的玉米的過氧化氬酶(CAT)活性是對(duì)照(添加等量失活SQR9菌液處理組)的1.75倍,接種SQR9的擬南芥的CAT活性增加到對(duì)照的2.19倍。接種SQR9的玉米內(nèi)GSH含量是對(duì)照組的2.43倍,接種SQR9的擬南芥內(nèi)GSH含量提高到對(duì)照組的2.49倍。在鹽脅迫下,接種SQR9的植物內(nèi)過氧化氫的含量顯著低于未接種SQR9的植物。通過分根實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫下接種SQR9導(dǎo)致根系環(huán)境中Na+含量顯著高于未接種對(duì)照,說明SQR9能夠協(xié)助植物排除Na+或者減少Na+的攝入。同時(shí)接種SQR9分別增加了玉米和擬南芥中Na+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,如SQR9增加了玉米中ZmNHX1,ZmNH2,ZmNHX3和ZmNH+-PPase基因的轉(zhuǎn)錄水平和擬南芥中AtNHX1和AtNHX7基因的轉(zhuǎn)錄水平,從而減少Na+對(duì)植物造成的傷害。通過透析袋截留不同分子量的SQR9分泌物,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)植物耐鹽的SQR9信號(hào)物質(zhì)的大小在100 Da到500 Da之間。通過進(jìn)一步檢測(cè)該范圍內(nèi)的分泌物所影響的植物耐鹽途徑,發(fā)現(xiàn)100～500 Da的SQR9分泌物主要通過提高玉米的GSH含量并減少Na+含量來促進(jìn)植物的鹽脅迫耐受性。而在擬南芥中,100～500 Da的SQR9信號(hào)物質(zhì)能夠增強(qiáng)CAT的活性、提高GSH含量并減少植物體內(nèi)Na+含量。并且,利用相關(guān)的擬南芥突變體進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)GSH合成相關(guān)基因(GS和GR)的敲除導(dǎo)致接種SQR9不能增強(qiáng)植物耐鹽能力,以及鹽過敏反應(yīng)(SOS)途徑關(guān)鍵基因(SOS1,SOS2,SOS3和NHX1)的敲除也會(huì)導(dǎo)致接種SQR9不能增強(qiáng)植物耐鹽能力,該結(jié)果進(jìn)一步證明了GSH含量的增加以及對(duì)SOS途徑的調(diào)控是SQR9 100～500Da的信號(hào)物質(zhì)協(xié)助植物耐受鹽脅迫的主要途徑。在對(duì)SQR9分泌的誘導(dǎo)植物耐受鹽脅迫的信號(hào)物質(zhì)的進(jìn)一步研究中,我們發(fā)現(xiàn)SQR9產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)(VOCs)不能顯著增強(qiáng)鹽脅迫下擬南芥的生物量,說明VOCs并非是SQR9誘導(dǎo)植物耐鹽脅迫的信號(hào)物質(zhì)�！鱵snE是SQR9的突變體,突變菌株的吲哚乙酸(IAA)產(chǎn)量顯著降低了 86%,通過用△ysnE接種鹽脅迫下的擬南芥,其相對(duì)應(yīng)的擬南芥鮮重和側(cè)根數(shù)目與接種野生型SQR9的擬南芥相比有所下降,但是與對(duì)照相比仍可以顯著增強(qiáng)鹽害下擬南芥的生物量,結(jié)果表明IAA并非是SQR9誘導(dǎo)植物耐鹽脅迫的主要信號(hào)物質(zhì)。通過用乙酸乙酯、乙醚、正戊烷、氯仿和水相萃取100～500 Da的SQR9發(fā)酵液,發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下,擬南芥莖葉的生物量在添加未經(jīng)過萃取的SQR9發(fā)酵液、水相SQR9發(fā)酵液、乙醚萃取的SQR9發(fā)酵液和氯仿萃取的SQR9發(fā)酵液的處理中相對(duì)于對(duì)照組分別提高了 75.75%、34.68%、53.21%和95.43%。而只有未經(jīng)過萃取的SQR9發(fā)酵液、乙醚萃取的SQR9發(fā)酵液和氯仿萃取的SQR9發(fā)酵液導(dǎo)致擬南芥根鮮重的顯著增加,增加幅度分別為35.75%、20.75%和70.9%,乙酸乙酯和正戊烷萃取的SQR9發(fā)酵液并沒有顯著增加擬南芥生物量。其中氯仿萃取的SQR9發(fā)酵液誘導(dǎo)植物耐鹽脅迫效果最佳,因此推測(cè)SQR9信號(hào)物質(zhì)應(yīng)極易被氯仿萃取。據(jù)報(bào)道,100～500Da之間的潛在的促進(jìn)植物耐受鹽脅迫的物質(zhì)主要包括赤霉素、玉米素、海藻糖和多胺類,通過液相色譜(HPLC)檢測(cè)SQR9發(fā)酵液,發(fā)現(xiàn)SQR9不能產(chǎn)生精胺,只能產(chǎn)生亞精胺。此外通過檢測(cè)100～500 Da的潛在信號(hào)物質(zhì)在上述溶劑中的溶解度,發(fā)現(xiàn)只有亞精胺在氯仿中的溶解度較高,該結(jié)果顯示,SQR9所分泌的能夠誘導(dǎo)植物耐受鹽脅迫的信號(hào)物質(zhì)可能是亞精胺。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),外源亞精胺增強(qiáng)植物耐鹽的有效濃度范圍是1～10μM,但是當(dāng)濃度大于500 μM時(shí)對(duì)植物生長(zhǎng)有抑制甚至致死作用。我們?cè)赟QR9找到了完整的亞精胺合成途徑,并通過同源重組雙交換,敲除SQR9內(nèi)亞精胺合成關(guān)鍵基因speB,得到突變子△speBB,并構(gòu)建了相應(yīng)的互補(bǔ)菌株c-△speB。通過HPLC對(duì)野生型SQR9、△speB、c-△speB菌株的亞精胺的產(chǎn)量進(jìn)行了分析,野生型3QR9和c-△speB胞外亞精胺的產(chǎn)量分別是26.40μM和22.20μM(OD600=1.0),胞內(nèi)亞精胺的產(chǎn)量是29.93和26.59μM (OD600=1.0),而突變子幾乎不產(chǎn)亞精胺,突變子和互補(bǔ)菌株的生長(zhǎng)曲線與野生型無(wú)顯著差異,說明speB基因的敲除和互補(bǔ)載體的融入并沒有影響到細(xì)菌的生長(zhǎng)。接種突變子△speB不能增強(qiáng)植物的耐鹽能力,互補(bǔ)菌株c-△speBB仍可以顯著增強(qiáng)植物耐鹽能力,說明亞精胺是SQR9誘導(dǎo)植物耐·鹽脅迫的重要信號(hào)物質(zhì)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),亞精胺能夠促進(jìn)植物GSH合成相關(guān)基因GS和GR的表達(dá),并提高植物GSH含量,從而緩解植物受到的氧化傷害;還能夠調(diào)控液泡上Ca2+通道蛋白基因TPC1的表達(dá)來改變細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+含量,從而激活SOS途徑,并提高液泡膜和細(xì)胞膜上的Na+通道蛋白基因NHX1和NHX7的表達(dá)來調(diào)節(jié)Na+的區(qū)域化,從而減少了植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Na+含量。綜上所述,SQR9能夠通過影響植物多條途徑促進(jìn)植物對(duì)鹽脅迫的耐受能力,主要通過合成亞精胺來促進(jìn)植物GSH的合成,從而緩解植物受到的氧化傷害;通過調(diào)控細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+含量來激活SOS途徑;以及調(diào)控Na+的區(qū)域化來減少植物細(xì)胞中的Na+,從而達(dá)到協(xié)助植物耐受鹽脅迫的效果。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S182

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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本文編號(hào)：1315255