本文關鍵詞：生物酶法合成肝素的多種關鍵酶制備和酶反應工程研究

  更多相關文章： 生物肝素 肝素合成前體 3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸 肝素修飾酶

【摘要】：肝素(heparin)是由糖醛酸和D-葡萄糖胺組成的線性硫酸化多糖,具有抗凝血、調(diào)血脂等重要的生物學功能,具有廣泛的醫(yī)學臨床應用。為解決傳統(tǒng)的動物源肝素在原料收集和生產(chǎn)環(huán)節(jié)中易受污染的問題,滿足全球市場對多類型肝素的巨大需求,開發(fā)非動物源肝素系列產(chǎn)品將對肝素的基礎研究及其臨床應用具有重要意義。非動物來源肝素主要有兩種制備途徑：一是以大腸桿菌K5發(fā)酵的肝素前體(heparosan)為底物,經(jīng)化學和酶法修飾得到生物工程肝素；二是以二糖為起始底物經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶以UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰葡萄糖胺(或UDP-N-三氟乙酰葡萄糖胺)為單糖供體逐個添加單糖得到七糖骨架,并經(jīng)化學和酶法修飾得到超低分子量肝素(Ultra-low molecular weight heparin, ULMWH)。但生產(chǎn)規(guī)模僅為毫克級別,距工業(yè)化生產(chǎn)還有很大的距離。主要的限制因素有1)肝素修飾酶硫磺基供體3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate, PAPS)價格昂貴且易分解,雖然酶法合成PAPS已經(jīng)實現(xiàn),但產(chǎn)量不高；2)肝素修飾酶的表達量低,很難大量獲得；3)目前肝素制備均采用純化后的游離酶進行反應,制備過程繁瑣,價格昂貴,且不能重復使用；4)ULMWH生產(chǎn)所需的單糖供體UDP-GlcNAc和UDP-GlcNTFA價格昂貴,產(chǎn)量不高。為了解決以上問題,本文開展了以下方面的研究工作：本文重組表達了三磷酸腺苷硫化酶和5'-腺苷磷酰硫酸激酶,構(gòu)建了一條體外高效合成PAPS的途徑。在最佳反應條件下,采用三磷酸腺苷分批補料策略,PAPS產(chǎn)量可達10.32 g/L,轉(zhuǎn)化率為81.4%。通過密碼子優(yōu)化、與麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein, MBP)融合表達以及表達條件優(yōu)化等策略,在大腸桿菌中表達了C5異構(gòu)化酶(C5 epimerase)、肝素2-O-磺基轉(zhuǎn)移酶(heparan sulfate 2-O-sulfotransferase,2OST)、肝素6-O-磺基轉(zhuǎn)移酶1 (heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 1,6OST1)、肝素6-O-磺基轉(zhuǎn)移酶3 (heparan sulfate 6-O-sulfotransferase3,60ST3)和肝素3-O-磺基轉(zhuǎn)移酶1 (heparan sulfate 3-O-sulfotransferase 1,3OST1)等酶法合成肝素關鍵酶,表達水平分別達到305、325、215、225和300 mg/L進一步研究了醛基化標簽固定肝素修飾酶的方法。通過蛋白理性設計,將醛基化標簽分別引入到MBP中的四處不同位置(E38H39, K170Y171, D209Y210和S352G353)。通過比較重組MBP表達量和對氨基樹脂的吸附能力,發(fā)現(xiàn)D2O9Y210(pMAl-mbp7-FGE)獲得最佳醛基化標簽引入位點的融合配體MBP。利用綠色熒光蛋白和精氨酸水解酶作為報告蛋白,證實氨基樹脂LX-1000HA對綠色熒光蛋白的結(jié)合率達90%,對精氨酸酶的結(jié)合率達71%。該固定化方法極大地提高了精氨酸酶操作穩(wěn)定性,在使用14次之后仍保留了53%的活性。將該方法應用于肝素修飾酶,高效制備了五種肝素修飾酶的固定化酶。利用固定化肝素修飾酶建立了合成肝素的工藝路線。肝素前體經(jīng)化學法脫乙酰基、加硫磺基后獲得N-硫磺化肝素前體(N-sulfo heparosan)。以自制PAPS為硫磺基供體,利用固定化酶C5 epimerase,2OST、6OST1和60ST3對N-sulfo heparosan進行一鍋法硫磺化修飾,然后利用固定化酶30ST1對上述反應物進一步硫磺化修飾得到生物工程肝素。經(jīng)30ST1修飾得到的生物工程肝素具有抗凝血活性,效價可達到1.4 IU。采用強陰離子交換(SAX)-高效液相色譜(HPLC)對肝素結(jié)構(gòu)進行分析,測定肝素經(jīng)酶法裂解后所得各種二糖的含量。根據(jù)定量分析,Heparosan中IV-A占100%,N-sulfo heparosan中IV-A占8.26%,IV-S占91.74%。而豬源的肝素中,Ⅳ-A、IV-S、Ⅱ-A、Ⅲ-A、Ⅱ-S、Ⅲ-S、Ⅰ-A和I-S所占的比例分別為1.98%、2.14%、3.65%、1.10%、10.44%、5.64%、0.76%和74.29%。這一工作為進一步生物合成肝素結(jié)構(gòu)鑒定奠定了基礎。最后,通過重組表達N-乙酰葡萄糖胺激酶、N-乙酰葡萄糖胺1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶和無機焦磷酸水解酶,構(gòu)建了一條體外高效合成UDP-GlcNAc和UDP-GlcNTFA的途徑。在優(yōu)化的反應條件下,采用分批補料策略,UDP-GlcNAc的產(chǎn)量達到59.51 g/L,生產(chǎn)力達到4.03 g·L-1.h-1,轉(zhuǎn)化率為92%；UDP-GlcNTFA的產(chǎn)量達到46.54 g/L,生產(chǎn)力達到3.32g·L-1·h·-1,轉(zhuǎn)化率為75.5%。這一個工作為超低分子肝素關鍵前體生產(chǎn)提供了高效生產(chǎn)技術(shù)。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q814

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1 鈔亞鵬,徐冠珠,程秀蘭,錢世鈞;固定化內(nèi)切型肝素酶的研究[J];微生物學報;2004年05期

2 張昌敬,陳朝碧;化學因素在制備豬肺肝素時對酶解的影響[J];重慶師范學院學報(自然科學版);1993年04期

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6 李建國;朱必龍;;測定肝素酶產(chǎn)生菌的簡單方法[J];國外醫(yī)學(微生物學分冊);1988年02期

7 葉逢春;陳銀;邢新會;;重組大腸桿菌生產(chǎn)可溶性MBP融合肝素酶的培養(yǎng)條件優(yōu)化[J];生物加工過程;2006年03期

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9 田曙光;虞立霞;李素波;高紅偉;王穎麗;宮鋒;;酶聯(lián)免疫吸附試驗定量檢測血清肝素酶方法的建立及應用[J];生物技術(shù)通訊;2009年04期

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1 孫永福;王鳳山;;肝素酶及其研究進展[A];2007年全國生化與生物技術(shù)藥物學術(shù)年會論文集[C];2007年

2 熊蕾;鈔亞鵬;趙鎮(zhèn)文;錢世鈞;熊少祥;;新型內(nèi)切肝素酶酶解產(chǎn)物肝素二糖的液相色譜分離和電噴霧質(zhì)譜表征[A];中國質(zhì)譜學會第七屆會員代表大會暨學術(shù)報告會論文集[C];2004年

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4 楊建民;韓曉梅;趙仲生;杜玲;王惠菊;費�，�;石淑青;;肝素酶多肽在胃癌組織芯片表達及其與患者預后的關系[A];第二屆浙江省消化病學術(shù)大會論文匯編[C];2009年

5 余彤;王惠菊;楊建民;周永列;葉再元;;Ianzai肝素酶HLA-A2限制性CTL表位的預測及鑒定[A];第二屆浙江省消化病學術(shù)大會論文匯編[C];2009年

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