本文關(guān)鍵詞：小鼠Nanog基因負調(diào)控作用的研究

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【摘要】：胚胎干細胞來源于哺乳動物胚胎的內(nèi)細胞團,具有在體外培養(yǎng)中保持無限自我更新并維持其多能性的能力。鑒于干細胞這種多向分化潛能,被期望用于再生醫(yī)學領(lǐng)域。然而干細胞干性維持和定向分化的精確調(diào)控機制尚不清楚,導致干細胞的臨床應用缺乏系統(tǒng)的理論指導,難以深入。因此研究干細胞干性維持和定向分化的調(diào)控機理具有重要的意義。Nanog蛋白是一個含有同源異形結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,對胚胎干細胞命運決定具有核心調(diào)控作用。解除Naong抑制因素可以提高誘導多能性干細胞(iPS)的誘導效率,并為干細胞定向分化提供理論基礎(chǔ)。因而研究Nanog基因負調(diào)控作用對于提高iPS誘導效率具有重要的意義。本論文采用實時定量PCR、Western blot、免疫熒光染色、基因表達譜芯片、小RNA測序等方法檢測基因表達水平變化;利用雙熒光素酶報告實驗和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)研究基因調(diào)控關(guān)系;借助體內(nèi)生物素化系統(tǒng)和Co-IP檢測技術(shù)研究Foxc1蛋白相互作用,從轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平研究了Naong基因的負調(diào)控作用,主要研究結(jié)果如下:1.發(fā)現(xiàn)Nanog基因在F9細胞分化過程中下調(diào)。分化的F9細胞表現(xiàn)為多能性因子Nanog下調(diào)、分化基因Foxc1上調(diào)、堿性磷酸酶水平降低。相關(guān)分化基因在NIH/3T3中高表達,而在F9細胞和胚胎干細胞中低表達,多能性基因如Nanog表達趨勢相反。2.揭示了Foxc1抑制Nanog表達的機理。構(gòu)建Foxc1真核表達載體p3×Flag-Foxc1,實時定量PCR和Western blot驗證載體可以正確表達。實驗發(fā)現(xiàn)Foxc1抑制Naong基因的mRNA和蛋白表達水平,但不影響多能性基因Oct4的表達。并且有效干涉Foxc1后得到一致性的實驗結(jié)果。揭示Foxc1對Nanog的作用不是由于胚胎干細胞多能性的降低產(chǎn)生的。構(gòu)建Nanog啟動子報告載體,進行雙熒光素酶報告實驗,結(jié)果指出Foxc1可以在啟動子水平調(diào)控Nanog的表達,從而影響Nanog mRNA和蛋白的表達。截掉-3128/-2224 bp的Nanog啟動子活性回升1.5倍。說明在此啟動子區(qū)域存在負調(diào)控元件。染色質(zhì)免疫共沉淀實驗證明了Foxc1可以結(jié)合在Nanog啟動子-3128/-2224 bp區(qū),從而發(fā)揮調(diào)控Naong的基因表達的作用。3.蛋白組學技術(shù)鑒定Foxc1相互作用蛋白。構(gòu)建Foxc1生物素化載體pBiotin-Foxc1,并構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)pBiotin-Foxc1的細胞系293T-Biotin-Foxc1和對照細胞系293T-Biotin,然后親和純化富集Foxc1的互作蛋白,進行質(zhì)譜鑒定。發(fā)現(xiàn)相關(guān)互作蛋白有p53、Carm1、Ehmt2、Wdr77、Gata6、Hdac2、Nedd8等。其中p53、Gata6、Carm1與Nanog調(diào)控關(guān)系已有報道,這就為Foxc1協(xié)同互作蛋白調(diào)控Nanog表達提供了有利的研究基礎(chǔ)。此外,組蛋白修飾相關(guān)蛋白如Ehmt2、Hdac2也被檢測到,這說明Foxc1對Nanog的調(diào)控作用機理,可能涉及表觀調(diào)控。4.發(fā)現(xiàn)Foxc1協(xié)同互作蛋白Tet3抑制Nanog基因的表達。F9中過表達Foxc1可以促進Tet3的表達,干涉Foxc1后,Tet3表達水平下降。構(gòu)建Tet3真核表達載體進行同樣實驗后,結(jié)果證實二者相互促進,并且Tet3抑制Naong的表達。Co-IP證明二者可以相互作用。這就說明Foxc1協(xié)同互作蛋白Tet3抑制Nanog基因的表達。5.抑制FGF-ERK通路促進Nanog基因的表達。建立“ground state”狀態(tài)的小鼠胚胎干細胞,其中最重要的因素之一就是抑制FGF-ERK信號。我們用小分子PD0325901抑制FGF-ERK信號通路,然后分析整體mRNA表達水平的變化。發(fā)現(xiàn)抑制FGF-ERK信號使分化基因下調(diào)和多能性基因上調(diào),并且促進典型胚胎干細胞克隆樣的形態(tài);多能性基因Nanog從低水平向高水平表達轉(zhuǎn)變,降低了Nanog表達的異質(zhì)性。抑制FGF-ERK通路后,利用小RNA測序分析整體microRNA(miRNA)的變化,發(fā)現(xiàn)大量差異miRNAs呈現(xiàn)下調(diào)趨勢,但部分有利于iPS誘導的miRNAs上調(diào)。同時繪制了miRNAs維持胚胎干細胞多能性的調(diào)控圖。6.FGF-ERK信號通路相關(guān)的miRNAs調(diào)節(jié)Nanog的表達。實驗結(jié)果表明miR-296抑制Nanog基因的表達,而抑制FGF-ERK通路后,miR-296被抑制。多能性基因Nanog表達水平被改變,從而促進小鼠胚胎干細胞的均一性。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78

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本文編號：1292203