本文關鍵詞：白蠟蟲低溫適應分子機制及抗凍蛋白功能研究

  更多相關文章： 白蠟蟲 抗凍 轉(zhuǎn)錄組 蛋白組 差異表達基因 抗凍蛋白 熱滯活性

【摘要】：長春越冬白蠟蟲雌成蟲能夠忍耐-30℃以下的極端低溫,能夠在東北的極端低溫環(huán)境下越冬并繁殖后代。白蠟蟲對低溫的適應性與自然種群分布關系極為密切,為了探討白蠟蟲的低溫適應機制,本研究采用高通量測序、熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,q-RT-PCR)檢測、基因克隆、原核表達、植物轉(zhuǎn)基因等方法,分析了長春越冬白蠟蟲雌成蟲的轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、與昆明越冬前白蠟蟲雌成蟲基因表達差異、抗凍蛋白(antifreeze protein,AFP)候選基因周年表達動態(tài)、afp候選基因序列特征、基因功能等,闡述了白蠟蟲適應極端低溫可能的分子機制,并從中挖掘到新型昆蟲afp基因。獲得的主要研究結(jié)果如下:(1)通過Illumina轉(zhuǎn)錄組測序,獲得54,934,590條raw reads,拼接后獲得161,005個轉(zhuǎn)錄本(transcript),預測有11,871個編碼序列(coding sequence,CDS)。在轉(zhuǎn)錄組中沒有注釋到抗凍蛋白。Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析表明,多數(shù)轉(zhuǎn)錄本富集在信號轉(zhuǎn)導和代謝過程中,其中MAPK信號通路、鈣離子信號通路、PI3K-Akt信號通路、可溶性糖、糖醇、游離氨基酸等的生物合成途徑占優(yōu)勢,對于白蠟蟲的低溫適應性具有重要意義。(2)通過蛋白質(zhì)全譜分析,獲得了蠟蟲在極端低溫下的蛋白組數(shù)據(jù),從中分離鑒定白蠟蟲抗凍相關的蛋白,如脂肪酸脫氫酶(fatty acid desaturase,FAD)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)、脫水蛋白(dehydrin)、熱激蛋白(heat shock protein,HSP)等。GO和KEGG分析表明,多數(shù)蛋白富集在信號轉(zhuǎn)導和代謝過程中,其中PPAR信號通路、MAPK信號通路、鈣離子信號通路占優(yōu)勢。采用random forest approach軟件在蛋白組中成功預測到388個抗凍蛋白。(3)通過RNA-Seq測序(RNA Sequencing)技術(shù)對昆明越冬前白蠟蟲雌成蟲進行了表達譜測序,分析了長春越冬白蠟蟲雌成蟲和昆明越冬前白蠟蟲雌成蟲基因表達的差異,共鑒定到2,386個差異表達的基因,其中1,124個基因上調(diào)表達,1,262個基因下調(diào)表達,其中hsp70差異表達顯著。這些差異表達基因主要參與糖代謝、精氨酸、脯氨酸代謝。(4)結(jié)合蛋白組和差異基因分析,以及random forest approach軟件預測結(jié)果,共篩選出39個白蠟蟲afp候選基因,進一步分析了這39個afp候選基因在長春和昆明白蠟蟲中的周年表達動態(tài),發(fā)現(xiàn)有10個afp候選基因的表達動態(tài)呈“山形”,符合afp基因的周年表達動態(tài)的特征。(5)對篩選出的10個白蠟蟲afp候選基因,進行了基因編碼框cDNA克隆,對獲得的序列進行序列特征分析、三級結(jié)構(gòu)預測和系統(tǒng)進化分析,生物信息學分析結(jié)果表明,預測的10個白蠟蟲afp候選基因具有AFP的序列和結(jié)構(gòu)特點。(6)對這10個白蠟蟲afp候選基因,利用同源重組構(gòu)建了原核表達載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。采用IPTG誘導,成功表達了1個白蠟蟲AFP,該蛋白在上清和菌體中均有表達,而且表達量大,蛋白具有活性,利用差示掃描量熱法測得熱滯活性為0.97℃。(7)對原核表達成功的afp基因進行植物表達載體構(gòu)建,采用農(nóng)桿菌介導的方法,將白蠟蟲afp基因整合到煙草的基因組中,過冷卻點(supercooling point,SCP)測試表明,轉(zhuǎn)基因植株和野生型對照相差0.36℃,但統(tǒng)計結(jié)果表明兩者的差異不顯著。本研究針對長春地區(qū)白蠟蟲越冬雌成蟲可以抵御當?shù)貥O端低溫的生物學現(xiàn)象,初步闡述了白蠟蟲低溫適應可能的分子機制,并還挖掘了白蠟蟲afp基因。該研究不但有助于了解白蠟蟲低溫適應性對其種群分布的影響,同時也有助于人們設計和生產(chǎn)出更多具有抗凍活性的分子。
【學位授予單位】：中國林業(yè)科學研究院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S899.1

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