本文關(guān)鍵詞：白蠟蟲低溫適應(yīng)分子機(jī)制及抗凍蛋白功能研究

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【摘要】：長(zhǎng)春越冬白蠟蟲雌成蟲能夠忍耐-30℃以下的極端低溫,能夠在東北的極端低溫環(huán)境下越冬并繁殖后代。白蠟蟲對(duì)低溫的適應(yīng)性與自然種群分布關(guān)系極為密切,為了探討白蠟蟲的低溫適應(yīng)機(jī)制,本研究采用高通量測(cè)序、熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,q-RT-PCR)檢測(cè)、基因克隆、原核表達(dá)、植物轉(zhuǎn)基因等方法,分析了長(zhǎng)春越冬白蠟蟲雌成蟲的轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、與昆明越冬前白蠟蟲雌成蟲基因表達(dá)差異、抗凍蛋白(antifreeze protein,AFP)候選基因周年表達(dá)動(dòng)態(tài)、afp候選基因序列特征、基因功能等,闡述了白蠟蟲適應(yīng)極端低溫可能的分子機(jī)制,并從中挖掘到新型昆蟲afp基因。獲得的主要研究結(jié)果如下:(1)通過(guò)Illumina轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,獲得54,934,590條raw reads,拼接后獲得161,005個(gè)轉(zhuǎn)錄本(transcript),預(yù)測(cè)有11,871個(gè)編碼序列(coding sequence,CDS)。在轉(zhuǎn)錄組中沒(méi)有注釋到抗凍蛋白。Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析表明,多數(shù)轉(zhuǎn)錄本富集在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝過(guò)程中,其中MAPK信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、可溶性糖、糖醇、游離氨基酸等的生物合成途徑占優(yōu)勢(shì),對(duì)于白蠟蟲的低溫適應(yīng)性具有重要意義。(2)通過(guò)蛋白質(zhì)全譜分析,獲得了蠟蟲在極端低溫下的蛋白組數(shù)據(jù),從中分離鑒定白蠟蟲抗凍相關(guān)的蛋白,如脂肪酸脫氫酶(fatty acid desaturase,FAD)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)、脫水蛋白(dehydrin)、熱激蛋白(heat shock protein,HSP)等。GO和KEGG分析表明,多數(shù)蛋白富集在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝過(guò)程中,其中PPAR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路占優(yōu)勢(shì)。采用random forest approach軟件在蛋白組中成功預(yù)測(cè)到388個(gè)抗凍蛋白。(3)通過(guò)RNA-Seq測(cè)序(RNA Sequencing)技術(shù)對(duì)昆明越冬前白蠟蟲雌成蟲進(jìn)行了表達(dá)譜測(cè)序,分析了長(zhǎng)春越冬白蠟蟲雌成蟲和昆明越冬前白蠟蟲雌成蟲基因表達(dá)的差異,共鑒定到2,386個(gè)差異表達(dá)的基因,其中1,124個(gè)基因上調(diào)表達(dá),1,262個(gè)基因下調(diào)表達(dá),其中hsp70差異表達(dá)顯著。這些差異表達(dá)基因主要參與糖代謝、精氨酸、脯氨酸代謝。(4)結(jié)合蛋白組和差異基因分析,以及random forest approach軟件預(yù)測(cè)結(jié)果,共篩選出39個(gè)白蠟蟲afp候選基因,進(jìn)一步分析了這39個(gè)afp候選基因在長(zhǎng)春和昆明白蠟蟲中的周年表達(dá)動(dòng)態(tài),發(fā)現(xiàn)有10個(gè)afp候選基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)呈“山形”,符合afp基因的周年表達(dá)動(dòng)態(tài)的特征。(5)對(duì)篩選出的10個(gè)白蠟蟲afp候選基因,進(jìn)行了基因編碼框cDNA克隆,對(duì)獲得的序列進(jìn)行序列特征分析、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和系統(tǒng)進(jìn)化分析,生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,預(yù)測(cè)的10個(gè)白蠟蟲afp候選基因具有AFP的序列和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。(6)對(duì)這10個(gè)白蠟蟲afp候選基因,利用同源重組構(gòu)建了原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。采用IPTG誘導(dǎo),成功表達(dá)了1個(gè)白蠟蟲AFP,該蛋白在上清和菌體中均有表達(dá),而且表達(dá)量大,蛋白具有活性,利用差示掃描量熱法測(cè)得熱滯活性為0.97℃。(7)對(duì)原核表達(dá)成功的afp基因進(jìn)行植物表達(dá)載體構(gòu)建,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,將白蠟蟲afp基因整合到煙草的基因組中,過(guò)冷卻點(diǎn)(supercooling point,SCP)測(cè)試表明,轉(zhuǎn)基因植株和野生型對(duì)照相差0.36℃,但統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明兩者的差異不顯著。本研究針對(duì)長(zhǎng)春地區(qū)白蠟蟲越冬雌成蟲可以抵御當(dāng)?shù)貥O端低溫的生物學(xué)現(xiàn)象,初步闡述了白蠟蟲低溫適應(yīng)可能的分子機(jī)制,并還挖掘了白蠟蟲afp基因。該研究不但有助于了解白蠟蟲低溫適應(yīng)性對(duì)其種群分布的影響,同時(shí)也有助于人們?cè)O(shè)計(jì)和生產(chǎn)出更多具有抗凍活性的分子。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S899.1

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 孫方人;抗凍蛋白[J];解放軍醫(yī)學(xué)情報(bào);1996年06期

2 黃福貞,韓花翠,曾曉林;植物抗凍蛋白及其應(yīng)用[J];生物學(xué)教學(xué);2000年12期

3 尹淑慧,馬克健;抗凍蛋白溶液中界面吸附的元胞自動(dòng)機(jī)模型[J];內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2000年06期

4 郭明星;抗凍蛋白溶液中界面吸附的元胞自動(dòng)機(jī)模型[J];長(zhǎng)春師范學(xué)院學(xué)報(bào);2000年02期

5 劉萬(wàn)勃,宋明,張中靈,周虹;抗凍蛋白的研究進(jìn)展[J];生物學(xué)雜志;2000年04期

6 尹明安,崔鴻文,樊代明,郭立;抗凍蛋白及其在植物抗凍基因工程中的應(yīng)用[J];西北植物學(xué)報(bào);2001年01期

7 鐘其旺,樊廷俊;魚類抗凍蛋白的研究進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);2002年02期

8 錢卓蕾,王君暉,邊紅武,韓凝;抗凍蛋白在超低溫保存中作用機(jī)制的新模型[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2002年04期

9 田云,盧向陽(yáng),張海文;抗凍蛋白研究進(jìn)展[J];中國(guó)生物工程雜志;2002年06期

10 楊秀芹,劉娣,于浩,于玲珠,孫繼權(quán);魚類抗凍蛋白的研究進(jìn)展及其在畜牧業(yè)上的應(yīng)用[J];動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué);2002年04期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 尉志武;DeVries;;抗凍蛋白與冰的作用機(jī)理研究[A];生命科學(xué)與生物技術(shù)：中國(guó)科協(xié)第三屆青年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];1998年

2 周艷霞;譚宏偉;陳光巨;;昆蟲抗凍蛋白中基因突變效應(yīng)的理論研究[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第九屆全國(guó)量子化學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨慶祝徐光憲教授從教六十年論文摘要集[C];2005年

3 劉俊杰;李前忠;;抗凍蛋白的二維吸附結(jié)合模型[A];第十次中國(guó)生物物理學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2006年

4 張黨權(quán);譚曉風(fēng);彭萬(wàn)喜;劉其梅;馬清芝;;胡蘿卜抗凍蛋白的新型生物抗凍劑的研制[A];第六屆中國(guó)功能材料及其應(yīng)用學(xué)術(shù)會(huì)議論文集（5）[C];2007年

5 謝文靜;劉俊杰;李前忠;;抗凍蛋白與冰晶表面結(jié)合的平衡方程[A];第十一次中國(guó)生物物理學(xué)術(shù)大會(huì)暨第九屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)摘要集[C];2009年

6 費(fèi)云標(biāo);魏令波;高素琴;舒念紅;江勇;陸漫春;王保懷;李芝芬;張有民;;植物抗凍蛋白純化、活性與二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定[A];第三屆全國(guó)現(xiàn)代生物物理技術(shù)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編[C];2000年

7 尉姍姍;尹林克;牟書勇;魯春芳;趙峰俠;;新疆沙冬青抗凍蛋白的提取分離及其熱滯活性測(cè)定[A];全國(guó)系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)研討會(huì)暨第九屆系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)青年研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

8 劉曉香;徐旭東;;小球藻南極株的兩個(gè)新的抗凍蛋白的研究[A];慶祝中國(guó)藻類學(xué)會(huì)成立30周年暨第十五次學(xué)術(shù)討論會(huì)摘要集[C];2009年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 王心見(jiàn);科學(xué)家發(fā)現(xiàn)新型抗凍蛋白[N];科技日?qǐng)?bào);2004年

2 吳偉農(nóng);加拿大科學(xué)家破譯昆蟲抗凍蛋白結(jié)構(gòu)[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2000年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 于淑惠;白蠟蟲低溫適應(yīng)分子機(jī)制及抗凍蛋白功能研究[D];中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院;2016年

2 毛新芳;新疆荒漠昆蟲光滑鱉甲抗凍蛋白的性質(zhì)及功能研究[D];新疆大學(xué);2011年

3 栗麗芬;第一類抗凍蛋白的統(tǒng)計(jì)力學(xué)研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2010年

4 王巖;中華齒刺甲的生物學(xué)特性及其抗凍蛋白的功能研究[D];新疆大學(xué);2013年

5 劉俊杰;抗凍蛋白熱滯活性的二維吸附結(jié)合模型[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2006年

6 王維香;沙冬青抗凍蛋白的分離純化及特性鑒定[D];大連理工大學(xué);2004年

7 李前忠;魚抗冷凍多肽的分子結(jié)構(gòu)和抗凍機(jī)理[D];內(nèi)蒙古大學(xué);1994年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉海超;抗凍蛋白熱滯活性的分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)吸附理論模型[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

2 鞏子路;新疆冷水魚中抗凍蛋白的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定[D];石河子大學(xué);2015年

3 王晶;光滑鱉甲抗凍蛋白表達(dá)規(guī)律研究及其天然抗凍蛋白純化初探[D];新疆大學(xué);2010年

4 其木格;抗凍蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2004年

5 胡煒;抗凍蛋白序列與結(jié)構(gòu)特征的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2014年

6 李素麗;不同結(jié)構(gòu)荒漠昆蟲抗凍蛋白表達(dá)及其活性比較[D];新疆大學(xué);2008年

7 蔡文萍;小胸鱉甲抗凍蛋白酵母表達(dá)條件優(yōu)化及應(yīng)用研究[D];新疆大學(xué);2012年

8 謝文靜;第一類魚抗凍蛋白對(duì)冰晶生長(zhǎng)界面層結(jié)構(gòu)的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2011年

9 崔寧寧;昆蟲抗凍蛋白的檢測(cè)、功能鑒定及轉(zhuǎn)基因應(yīng)用[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

10 溫歡;抗凍蛋白序列的模體分析與預(yù)測(cè)[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2013年

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