本文關(guān)鍵詞：乳酸菌的生長抑制和凍干存活的影響因素及規(guī)律

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【摘要】：乳酸菌因其良好的發(fā)酵性能及優(yōu)越的益生特性深受青睞,為提高乳酸菌的培養(yǎng)濃度及菌劑的制備效率需明確乳酸菌的生長抑制因素及影響凍干存活的關(guān)鍵工藝控制點。本文系統(tǒng)研究了不同同型發(fā)酵乳桿菌和雙歧桿菌生長的主要抑制因素,并歸納分析了兩種發(fā)酵類型的菌株最高生物量的規(guī)律;然后基于生長抑制規(guī)律提出了離子交換高密度培養(yǎng)法,研究了該方法對菌株生長的影響;最后分析菌劑制備時菌泥與保護劑混合過程中的產(chǎn)酸情況及其對凍干存活的影響。主要研究結(jié)果如下:系統(tǒng)分析不同同型發(fā)酵乳桿菌分批培養(yǎng)和恒pH(7.0)補料分批培養(yǎng)至最高生物量時代謝產(chǎn)物積累與底物消耗,發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)方式均不存在底物抑制,低pH值和有機酸的積累是分批培養(yǎng)抑制乳桿菌生長的主要因素。通過測定乳酸鈉、乙酸鈉和氯化鈉在中性時對不同同型發(fā)酵乳桿菌的最低抑菌濃度,發(fā)現(xiàn)除鼠李糖乳桿菌外,酸根對植物乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌及嗜酸乳桿菌的最低抑菌濃度與氯化鈉的最低抑菌濃度相同;且恒pH(7.0)補料分批培養(yǎng)完全抑制菌株生長時乳酸根積累濃度與乳酸根在中性時對乳桿菌的最低抑菌濃度無顯著差異,菌株被完全抑制時發(fā)酵液的滲透壓與添加最低抑菌濃度乳酸鈉的培養(yǎng)基的滲透壓無顯著差異。結(jié)果表明,胞外酸根積累引起的滲透壓升高是恒pH(7.0)補料分批培養(yǎng)抑制大部分同型發(fā)酵乳桿菌生長的主要因素,滲透壓升高和酸根的毒害作用是鼠李糖乳桿菌的主要抑制因素。另外,分析乳酸菌酸根積累與產(chǎn)菌量的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)所有的同型發(fā)酵乳桿菌在乳酸根積累至其對菌株的最低抑菌濃度時停止生長,不同同型發(fā)酵乳桿菌最高生物量(X_(max))與乳酸根對菌株的最低抑菌濃度(C)及分泌單位乳酸的產(chǎn)菌量(Y_(X/P))有關(guān),同型發(fā)酵乳桿菌的最高生物量符合以下規(guī)律:X_(max)-X_0=(0.59±0.02)·Y_(X/P)·C。系統(tǒng)分析了兩歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、長雙歧桿菌嬰兒亞種、青春雙歧桿菌及動物雙歧桿菌等不同雙歧桿菌分批培養(yǎng)和恒pH(7.0)補料分批培養(yǎng)的主要抑制因素,發(fā)現(xiàn)低pH值和有機酸的積累是分批培養(yǎng)抑制雙歧桿菌生長的主要因素。乳酸根、乙酸根及混合酸根在中性時對雙歧桿菌的最低抑菌濃度與氯化鈉的最低抑菌濃度相同;恒pH(7.0)補料分批培養(yǎng)完全抑制菌株生長時總酸根積累濃度與酸根在中性時對雙歧桿菌的最低抑菌濃度無顯著差異,菌株被完全抑制時發(fā)酵液的滲透壓與添加最低抑菌濃度酸根的培養(yǎng)基的滲透壓無顯著差異。結(jié)果表明,胞外酸根積累引起的滲透壓升高是恒pH(7.0)補料分批培養(yǎng)抑制雙歧桿菌生長的主要因素。另外,發(fā)現(xiàn)不同雙歧桿菌的最高生物量(X_(max))同樣具有規(guī)律性,其與酸根的最低抑菌濃度(C)及分泌單位酸根的產(chǎn)菌量(Y_(X/P))高度相關(guān),雙歧桿菌的最高生物量符合以下規(guī)律:X_(max)-X_0=(0.71±0.03)·Y_(X/P)·C。測定不同同型發(fā)酵乳桿菌和雙歧桿菌生長期間葡萄糖代謝成酸的轉(zhuǎn)化率,發(fā)現(xiàn)所有被測乳酸菌均將90%左右的葡萄糖轉(zhuǎn)化成酸,由此將補料與補堿進行關(guān)聯(lián)(關(guān)聯(lián)比例為k:1,即補加1 m L堿液自動補加k m L補料培養(yǎng)基),補堿量即為產(chǎn)酸量,根據(jù)堿消耗及糖代謝成酸的轉(zhuǎn)化率可知底物的消耗量,按照以下公式:C_堿/40×2×90%=C_堿/180?k(同型發(fā)酵乳桿菌);C_堿/40×5×90%=C_堿/180×2?k(雙歧桿菌)配制堿液濃度和補料培養(yǎng)基葡萄糖濃度,根據(jù)堿自動反饋補料時,底物的補加遵循消耗規(guī)律,確保了培養(yǎng)體系底物的穩(wěn)定性。恒pH(7.0)補料分批培養(yǎng)植物乳桿菌CCFM 8610,以滲透壓作為唯一抑制因素擬合其生長動力學(xué),得到方程:μ=(0.96±0.09)×(1-(O-(336±1)/(2416±97)-(336±1))~ (0.25±0.04))。該動力學(xué)表明菌株對滲透壓比較敏感,在滲透壓升高時生長速率快速降低;隨著滲透壓的繼續(xù)升高,該菌株的生長速率緩慢降低。通過測定不同陰離子交換樹脂在37℃時對乳酸根的吸附容量及對葡萄糖和氨基酸的選擇性,篩選得到最優(yōu)的陰離子交換樹脂D319。將其轉(zhuǎn)型為OH~-應(yīng)用到自主設(shè)計的離子交換生物反應(yīng)器中高密度培養(yǎng)植物乳桿菌CCFM 8610。結(jié)果表明,酸根選擇性解除后,菌株能夠繼續(xù)增殖,其生長符合滲透壓動力學(xué)方程,證實了酸根引起的滲透壓升高是植物乳桿菌恒pH(7.0)補料分批培養(yǎng)的主要抑制因素。該離子交換生物反應(yīng)器為提高乳酸菌的生長濃度提供了新培養(yǎng)方法,利用此系統(tǒng)培養(yǎng)植物乳桿菌CCFM 8610,12 h后細胞干重達到34.5 g/L,分別是分批培養(yǎng)的13.3倍,恒pH(7.0)補料分批培養(yǎng)的3.3倍。真空冷凍干燥是乳酸菌菌粉制備的關(guān)鍵技術(shù)手段,在凍干前須將菌泥與保護劑混勻并進行預(yù)凍。系統(tǒng)研究菌泥與保護劑混勻過程中的代謝產(chǎn)酸情況,及產(chǎn)酸引起的pH值降低對凍干存活的影響。測定了不同乳酸菌添加保護劑后在室溫和冷藏溫度下的產(chǎn)酸速率,以及不同pH值條件下預(yù)凍及凍干后菌株的存活率,并分析了不同pH值條件下預(yù)凍和凍干對菌株ATP酶、β-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶及細胞膜完整性和流動性的影響。結(jié)果表明,菌泥與保護劑混合后,室溫環(huán)境下會快速產(chǎn)酸引起菌懸液pH值的降低,影響乳酸菌的預(yù)凍和凍干存活。pH值降至4.0時,預(yù)凍階段菌株的存活率出現(xiàn)顯著降低,凍干結(jié)束后存活率進一步降低;pH值降至5.0時,菌株在預(yù)凍階段的存活率未受到影響,但凍干結(jié)束后存活率顯著降低。低pH環(huán)境下菌株預(yù)凍和凍干存活率的降低歸因于酸加重了預(yù)凍及凍干過程引起的乳酸菌ATP酶和β-半乳糖苷酶的損傷及細胞膜流動性的降低。通過分析保護劑的量與能夠保護的不同乳桿菌最多的菌泥濕重(m)、總菌數(shù)量(N)、菌株細胞膜總表面積(S_t)、菌株總體積(V_t)的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)即使菌種不同,但是菌株的細胞膜總表面積與保護劑的量高度相關(guān)。保護劑的量與不同乳桿菌細胞膜的總表面積符合以下規(guī)律:N·(4πr~2+2πl(wèi))=(0.66±0.03)·M,根據(jù)此規(guī)律可推斷凍干前保護劑的最適添加量。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TS201.3

【參考文獻】

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本文編號：1286899