本文關(guān)鍵詞：水稻紫色酸性磷酸酶OsPAP10a和OsPAP10c的功能研究

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【摘要】：磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量元素之一。自然界中磷含量相當(dāng)豐富,但大部分以有機(jī)磷化合物形式存在,能被植物直接吸收利用的無機(jī)磷含量常常低于植物生長(zhǎng)所需的濃度,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中需要大量施用磷肥來實(shí)現(xiàn)作物高產(chǎn)。但磷肥的過度使用,不僅增加了生產(chǎn)成本,也是水體富營(yíng)養(yǎng)化的重要成因。提高作物的磷養(yǎng)分吸收效率,對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的意義重大。缺磷條件下,植物能合成并向根外分泌紫色酸性磷酸酶(Purple acid phosphatases, PAPs),從而水解植物根部周圍的有機(jī)磷化合物,釋放出無機(jī)磷供植物生長(zhǎng)所需。研究表明,PAP Ⅰa亞家族在植物有機(jī)磷的利用及缺磷適應(yīng)中具有重要作用。水稻PAP Ⅰa亞家族包括OsPAP10a、OsPAP10b、OsPAP10c、OsPAP10d和OsPAP26。定量逆轉(zhuǎn)錄PCR (qRT-PCR)分析顯示,OsPAP10a在地上部分和地下部分均受缺磷特異誘導(dǎo),而OsPAP10c只在地下部分受缺磷特異誘導(dǎo)。OsPAP10b和OsPAP10d在各組織和各個(gè)發(fā)育時(shí)期表達(dá)都很低,而OsPAP26在各個(gè)組織中均有較高的表達(dá)。本研究主要對(duì)象是PAP Ⅰa亞家族的OsPAP10a和OsPAP10c的功能。通過構(gòu)建OsPAP10a和OsPAP10c啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因的載體并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,研究獲得了OsPAP10a和OsPAP10c啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因株系。轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色分析證實(shí)了OsPAP10a在地上部分和地下部分均受缺磷特異誘導(dǎo),而OsPAP10c只在地下部分受缺磷特異誘導(dǎo)。根部切片顯示,OsPAP10a和OsPAP10c主要表達(dá)于根的表皮和外皮層,OsPAP10c在葉、幼穗和花粉中都有表達(dá)。根表面酸性磷酸酶(Acid Phosphatase, APase)活性定性染色(BCIP染色)結(jié)果表明,OsPAP10a和OsPAP10c超表達(dá)株系根表面的染色增強(qiáng),但超表達(dá)OsPAP10c的轉(zhuǎn)基因株系根表面的染色深于超表達(dá)OsPAP10a的轉(zhuǎn)基因株系。利用APase活性定量分析,檢測(cè)了植物根表面、植物地上和地下部分組織中、及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的介質(zhì)(水培液)中的APase活性。結(jié)果表明,與野生型(Wild Type,WT)植株相比,超表達(dá)OsPAP10c使根表面APase活性增加約10倍,而超表達(dá)OsPAP10a使根表面APase活性僅增加2倍；OsPAP10c超表達(dá)株系地上和地下部分組織中APase活性增加約5倍,而OsPAP10a超表達(dá)材料僅增加1.5-2倍；在供磷條件下,超表達(dá)OsPAP10a的轉(zhuǎn)基因懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中的APase活性較其野生型對(duì)照提高了近2倍,而超表達(dá)OsPAP10c使懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中的PAP酶活提高了10倍以上�？梢�,OsPAP10c在水稻中較OsPAP10a具有更顯著的功能和應(yīng)用潛力。植株地上和地下部分組織的總蛋白經(jīng)非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離及APase活性染色后,清晰地獲得了APase同工酶的條帶。結(jié)果表明,OsPAP10a超表達(dá)株系增加A2條帶活性。OsPAP10c超表達(dá)株系誘導(dǎo)A1、A3、A4和A5條帶�；钚阅z染色和Western蛋白印跡分析懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中的蛋白發(fā)現(xiàn),OsPAP10c在水稻細(xì)胞中主要分泌到細(xì)胞外,因而在培養(yǎng)液中大量存在。為了明確OsPAP10a和OsPAP10c基因在培育磷養(yǎng)分高效水稻品種中的應(yīng)用前景,研究還對(duì)二基因的超表達(dá)株系進(jìn)行了有機(jī)磷(ATP)降解實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,OsPAP10c超表達(dá)株系能顯著提高ATP降解速率及利用效率。在只添加有機(jī)磷的水培溶液培養(yǎng)5天時(shí),野生型葉片磷含量降低56%,而OsPAP10a超表達(dá)材料葉片磷含量只下降25%,OsPAP10c超表達(dá)材料葉片磷含量?jī)H下降8%到24%。綜上所述,本論文對(duì)水稻OsPAP10a和OsPAP10c兩個(gè)紫色酸性磷酸酶的功能進(jìn)行分析和比較。相比于OsPAP10a, OsPAP10c是一個(gè)更為重要的分泌型酸性磷酸酶,在細(xì)胞外有機(jī)磷利用中具有重要的作用,在水稻磷高效品種改良中具有潛在的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q946

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