本文關(guān)鍵詞：新城疫病毒M蛋白功能性氨基酸突變和M蛋白與膜聯(lián)蛋白A6互作影響病毒復(fù)制分子機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 新城疫病毒 M蛋白 病毒復(fù)制 蛋白相互作用 膜聯(lián)蛋白A6

【摘要】：新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是副黏病毒科(Paramyxoviridaae),禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)的一個(gè)成員,為具有囊膜且含單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA基因組的病毒,其基因組大小約為15.1kb,至少編碼6種病毒蛋白。其中,M蛋白是含量最為豐富且高度保守的非糖基化膜相關(guān)蛋白,主要位于病毒囊膜內(nèi)表面,構(gòu)成病毒內(nèi)膜與核衣殼蛋白連接的支架。同其它副黏病毒M蛋白一樣,NDV M蛋白也具有細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)穿梭特性。在病毒感染早期,M蛋白主要聚集在細(xì)胞核和核仁中,并且在整個(gè)感染過(guò)程中持續(xù)存在于核仁中,其主要功能是抑制宿主細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,并確保病毒基因組在細(xì)胞質(zhì)中有充足的時(shí)間進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄;而在感染后期,M蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)能夠通過(guò)與糖蛋白的胞質(zhì)區(qū)、病毒核衣殼蛋白以及宿主細(xì)胞膜發(fā)生相互作用,以協(xié)助子代病毒粒子進(jìn)行裝配和釋放。因此,M蛋白是一種多功能病毒結(jié)構(gòu)蛋白,在病毒復(fù)制的過(guò)程中,尤其是在病毒的組裝和出芽釋放階段發(fā)揮著核心的作用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的前期工作,已經(jīng)確定了M蛋白對(duì)新城疫病毒的復(fù)制及致病性存在重要的影響。然而目前為止,對(duì)M蛋白在NDV復(fù)制過(guò)程中的作用還有諸多未知的地方。本研究旨在探索M蛋白功能性氨基酸位點(diǎn)突變以及M蛋白與宿主細(xì)胞蛋白相互作用影響病毒復(fù)制的分子機(jī)制為研究目的,為進(jìn)一步闡明M蛋白在NDV復(fù)制中的作用奠定基礎(chǔ)。1.鴿副粘病毒1型M蛋白R(shí)36Q突變致弱病毒毒力及復(fù)制能力鴿副粘病毒1型(PPMV-1)是一種能夠特異性的感染宿主鴿子的病原體,通常被認(rèn)為是禽副粘病毒1型(APMV-1)在鴿子上的適應(yīng)性變種。有研究報(bào)道PPMV-1的這種適應(yīng)性變化與病毒基因及蛋白的變化有關(guān),但是到目前為止,這種變化與病毒的生物學(xué)特性的關(guān)系仍未見報(bào)道。M蛋白通常被認(rèn)為是僅次于F和HN蛋白的毒力因子,而M蛋白在病毒感染的早期過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。有報(bào)道M蛋白對(duì)于PPMV-1的遺傳進(jìn)化及宿主適應(yīng)性可能有重要作用。本研究首先對(duì)145株新城疫毒株(39株P(guān)PMV-1,106株APMV-1)進(jìn)行了氨基酸序列比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)了 7個(gè)特異性氨基酸位點(diǎn)分別位于M,F,HN及L蛋白上,其中R36是位于M蛋白上的特異性氨基酸位點(diǎn),同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)R36位點(diǎn)是M蛋白上的正向選擇位點(diǎn);隨后我們以PPMV-1 Js/07/04/Pi(071204)株全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒pNDV/071204為骨架構(gòu)建了 M蛋白R(shí)36Q突變的重組病毒r071204-M.R36Q,為了進(jìn)行反向比較,同時(shí)構(gòu)建了以表達(dá)綠色熒光蛋白的NDV ZJ1株全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒pNDV/ZJ1GFP為骨架構(gòu)建了 M蛋白Q36R突變的重組病毒rZJ1GFP-M.Q36R。對(duì)兩株重組病毒及其母本病毒進(jìn)行生物學(xué)特性測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),R36Q突變能夠致弱r071204在細(xì)胞和雞胚上的毒力并降低病毒復(fù)制能力,而Q36R突變對(duì)于rZJ1GFP母本病毒的各項(xiàng)生物學(xué)特性的影響沒有顯著差異。另外,鴿子攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,R36Q突變使得r071204-M.R36Q重組病毒在排毒時(shí)間及排毒量上都要顯著低于母本病毒r071204。以上結(jié)果說(shuō)明PPMV-1 M蛋白的R36可能是病毒宿主適應(yīng)性的一個(gè)關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn),對(duì)PPMV-1的復(fù)制能力、致病性及傳播具有至關(guān)重要的作用。2.新城疫病毒M蛋白G275A和P276A聯(lián)合突變影響病毒的復(fù)制和出芽據(jù)報(bào)道,M蛋白在病毒感染后期在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)進(jìn)行病毒粒子的組裝和出芽依賴于M蛋白C-端由2個(gè)α-螺旋包裹2個(gè)反向平行的β-折疊形成的特異性折疊結(jié)構(gòu)與宿主細(xì)胞膜結(jié)合,后續(xù)研究推測(cè),NDV M蛋白的275位G與鄰近的276位P形成的GP組合對(duì)M蛋白形成正確的β-折疊極為重要。本研究中,我們首先對(duì)過(guò)去的研究結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,通過(guò)將NDV M蛋白序列與其他副黏病毒M蛋白序列進(jìn)行氨基酸比對(duì),并結(jié)合三維結(jié)構(gòu)模擬分析,我們證實(shí)NDV M蛋白C-端的LGP序列能夠發(fā)揮類似雙重氨基酸G的作用,當(dāng)GP突變?yōu)锳A時(shí),M蛋白的折疊發(fā)生了角度的變化,影響了 M蛋白功能的發(fā)揮,繼而,我們拯救了兩株突變重組病毒,分別是rZJ1GFP-M.LGP/GGL,rZJ1GFP-M.GP/AA,生物學(xué)特性測(cè)定的結(jié)果顯示,GP/AA突變重組病毒顯著降低了病毒在雞胚及細(xì)胞上的復(fù)制能力和致病性,動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明GP/AA突變?cè)斐闪瞬《镜闹氯?以上結(jié)果均說(shuō)明GP序列對(duì)于病毒復(fù)制及致病性是至關(guān)重要的,此外,對(duì)重組病毒在細(xì)胞上的出芽能力進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明GP/AA突變后能夠大幅損傷病毒出芽能力,間接說(shuō)明GP/AA突變導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)變化影響了病毒粒子的出芽,這也解釋了為何病毒的復(fù)制能力下降。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明M蛋白上的GP序列在NDV的生活周期中發(fā)揮了極為重要的作用。然而,仍需進(jìn)一步通過(guò)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)闡釋GP影響出芽的具體機(jī)制。3.新城疫病毒M蛋白羧基端功能結(jié)構(gòu)域影響病毒的早期復(fù)制本研究對(duì)NDV ZJ1株M蛋白C-端影響二聚體矩陣形成的氨基酸進(jìn)行突變,并觀察點(diǎn)突變對(duì)M蛋白亞細(xì)胞定位的影響,然后通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救點(diǎn)突變病毒,進(jìn)一步研究點(diǎn)突變對(duì)病毒復(fù)制和致病性的影響。結(jié)果顯示,M蛋白C-端D255、E258、R262、R263氨基酸單點(diǎn)突變以及255/258(DE)雙點(diǎn)突變后,不影響M蛋白細(xì)胞核和核仁定位,但是262/263(RR)、255/263、258/262雙突變后導(dǎo)致M蛋白由細(xì)胞核及核仁定位變?yōu)榧?xì)胞質(zhì)定位,隨后我們以表達(dá)綠色熒光蛋白的NDVZJ1株全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒pNDV/ZJ1GFP為骨架構(gòu)建了 M蛋白相應(yīng)的單點(diǎn)突變及雙點(diǎn)突變?nèi)L(zhǎng)質(zhì)粒pNDV/ZJ1GFP-Mwt,利用反向遺傳學(xué)技術(shù),成功拯救出8株重組病毒。生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果顯示,單點(diǎn)及雙點(diǎn)突變均不能導(dǎo)致病毒的生物學(xué)特性發(fā)生改變。然而,255/258(DE)、262/263(RR)、255/263、258/262雙突變病毒在DF1細(xì)胞中早期的增殖能力、CPE形成能力及表達(dá)GFP能力均顯著下降,說(shuō)明雙突變僅僅降低了病毒的早期復(fù)制能力和致病性。我們的研究結(jié)果表明影響M蛋白二聚體矩陣形成的氨基酸位點(diǎn)能夠影響M蛋白的細(xì)胞核定位,并且降低病毒的早期復(fù)制能力和致病性。4.新城疫病毒M蛋白與細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A6相互作用影響病毒的復(fù)制由于病毒編碼蛋白能力的限制,病毒不能編碼出復(fù)制所需的所有蛋白,因此,病毒往往需要利用宿主細(xì)胞蛋白或細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分來(lái)完成病毒的復(fù)制過(guò)程。本研究中我們首先通過(guò)激光共聚焦對(duì)M蛋白與宿主膜聯(lián)蛋白A6(ANXA6)蛋白在細(xì)胞中的定位情況進(jìn)行了觀察,結(jié)果顯示M蛋白與ANXA6蛋白在細(xì)胞質(zhì)中存在著共定位。此后,通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)和GST Pull-down實(shí)驗(yàn),我們進(jìn)一步驗(yàn)證了 M蛋白與ANXA6蛋白能夠發(fā)生互作。通過(guò)His Pull-down方法對(duì)M蛋白與ANXA6相互作用結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)M蛋白aa250-280是M蛋白與ANXA6蛋白結(jié)合的區(qū)域。為了探索ANXA6蛋白與M蛋白互作對(duì)病毒復(fù)制的影響,我們?cè)O(shè)計(jì)了 RNA干擾實(shí)驗(yàn)以及宿主細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)ANXA6實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,抑制ANXA6蛋白表達(dá)能夠促進(jìn)病毒感染細(xì)胞病變的產(chǎn)生并提高了病毒的復(fù)制效率,說(shuō)明ANXA6的存在抑制了病毒的復(fù)制;另一方面,細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)ANXA6蛋白顯著減輕了 NDV感染細(xì)胞引起的CPE并抑制了病毒的增殖,說(shuō)明在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)ANXA6明顯降低了病毒的復(fù)制。以上結(jié)果表明,宿主ANXA6蛋白能夠負(fù)調(diào)節(jié)NDV的復(fù)制過(guò)程。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 聆風(fēng);;科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了更多的病毒復(fù)制和傳播的內(nèi)在機(jī)制[J];中華醫(yī)學(xué)信息導(dǎo)報(bào);2006年09期

2 于學(xué)東;姜濤;陳水平;鄧永強(qiáng);韓劍峰;趙慧;李曉峰;劉然;于曼;秦成峰;秦鄂德;;登革4型病毒5′非編碼區(qū)SLB元件對(duì)病毒復(fù)制和翻譯的調(diào)控作用[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2008年07期

3 胡克勤,喻植群,李方和,張永源,郝連杰;乙型肝炎病毒前S蛋白檢測(cè)及其與病毒復(fù)制標(biāo)志的關(guān)系[J];上海免疫學(xué)雜志;1989年06期

4 曾令蘭;熊開鈞;黃華芳;何生松;羅端德;王心禾;代家珠;劉紅艷;;乙型肝炎病毒持續(xù)感染患者細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制的研究[J];病毒學(xué)雜志;1991年01期

5 ;快訊[J];生物工程學(xué)報(bào);2010年04期

6 張陽(yáng)根,胡雅遠(yuǎn),江先海;檢測(cè)PHSAR的固相血凝法[J];上海免疫學(xué)雜志;1991年01期

7 高飛;鄭浩;姜一峰;李麗薇;鄭海紅;周艷君;韋祖樟;童光志;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒5'非翻譯區(qū)一頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)是病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄必需的順式作用元件[J];中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào);2014年04期

8 戴利成;王翠妮;何建方;錢佳平;王偉洪;施柏年;;血清乙肝病毒外膜大蛋白檢測(cè)及其與病毒復(fù)制的關(guān)系[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;2006年03期

9 陳湖光;馬亦林;;流行性出血熱病毒致病作用的研究進(jìn)展(綜述)[J];浙江醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1991年03期

10 朱艷萍;蔣建東;彭宗根;;APOBEC3G抑制病毒復(fù)制作用機(jī)制研究進(jìn)展[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2014年01期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 江玲;許智慧;劉妍;李曉東;姚偉明;李韋杰;戴久增;辛紹杰;徐東平;;HBV基因組A1846T變異對(duì)病毒復(fù)制力及核心啟動(dòng)子活性的上調(diào)作用研究[A];第7屆全國(guó)疑難及重癥肝病大會(huì)論文集[C];2013年

2 戴煒;郭亞兵;楊大國(guó);唐蔚;袁靜;王召欽;舒丹;;深圳地區(qū)HBV感染者病毒前C區(qū)變異與病毒復(fù)制水平關(guān)系[A];第九次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2000年

3 李艷梅;梁國(guó)棟;張仲凱;方榮祥;郝小江;;Glaucogenin C及其苷抑制正鏈RNA病毒復(fù)制活性及其作用機(jī)制研究[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第二十五屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集（下冊(cè)）[C];2006年

4 許利軍;吳南屏;;CD38分子和HIV感染的關(guān)系[A];2005年浙江省感染病、肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

5 陸偉;張占卿;;血清β2-微球蛋白與慢性肝炎疾病程度和病毒復(fù)制之間的關(guān)系[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)全國(guó)第九次感染病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

6 孫正偉;孫向陽(yáng);王威;董振芳;;乙型肝炎病毒基因分型與病毒復(fù)制的關(guān)系[A];第五屆全國(guó)肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

7 王強(qiáng);汪光蓉;凡瞿明;何蘭;蔡艷娟;毛明;杜琴;張國(guó)元;;乙型肝炎病毒核酸相關(guān)抗原在評(píng)價(jià)病毒復(fù)制中的應(yīng)用價(jià)值[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)醫(yī)院協(xié)會(huì)臨床檢驗(yàn)管理專業(yè)委員會(huì)第六屆全國(guó)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

8 江玲;許智慧;劉妍;辛紹杰;徐東平;;HBV基因組C1913A/G變異對(duì)病毒復(fù)制力影響及核心區(qū)融合蛋白pEGFP-Core-N1真核表達(dá)載體的構(gòu)建[A];第7屆全國(guó)疑難及重癥肝病大會(huì)論文集[C];2013年

9 宋煜;楊曉霞;王沛麗;程欣;韓陽(yáng);羅震;曹燕華;祝成亮;劉映樂;劉芳;鄔開朗;吳建國(guó);;EV71激活的早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白1通過(guò)直接與病毒的5′非翻譯區(qū)結(jié)合從而促進(jìn)病毒復(fù)制[A];2013年湖北省暨武漢微生物學(xué)會(huì)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2013年

10 黃利華;蔣躍明;童福易;曹立森;黃祖瑚;;HBVPreC/C變異對(duì)抗-HBc缺失和病毒復(fù)制的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)感染病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前9條

1 中證證券研究中心;重啤疫苗抑制病毒復(fù)制無(wú)顯著優(yōu)勢(shì)[N];中國(guó)證券報(bào);2012年

2 毛磊;阻止非典病毒復(fù)制鼠可“自產(chǎn)”抗體[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2004年

3 唐風(fēng);美稱Rab9蛋白與病毒復(fù)制有關(guān)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

4 方留民;硒的保健作用[N];中國(guó)食品質(zhì)量報(bào);2001年

5 聞欣;Trim5-α可抑制HIV復(fù)制[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2004年

6 記者 江南;中歐非典研究獲重大進(jìn)展[N];人民日?qǐng)?bào)海外版;2005年

7 劉彬;乙肝需要復(fù)查的化驗(yàn)項(xiàng)目有哪些[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報(bào);2005年

8 張濤 譯;老藥沖鋒在前沿[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2002年

9 毛文波;可抑制艾滋病病毒復(fù)制的特效分子問世[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 鄧萍;蕪菁花葉病毒CI蛋白參與病毒復(fù)制和運(yùn)動(dòng)及其與寄主的相互作用研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2015年

2 張禮洲;VP2互作蛋白CK1α及CSGalNAcT2在雞傳染性法氏囊病病毒復(fù)制中的作用及分子機(jī)制研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

3 郝洪平;氯化鋰抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制機(jī)制的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

4 宋煜;腸道病毒71型(EV71)調(diào)控EGR1表達(dá)及其促進(jìn)病毒復(fù)制的研究[D];武漢大學(xué);2014年

5 許海旭;新城疫病毒M蛋白功能性氨基酸突變和M蛋白與膜聯(lián)蛋白A6互作影響病毒復(fù)制分子機(jī)制[D];揚(yáng)州大學(xué);2016年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張琦;桿狀病毒DNA甲基化及其在病毒復(fù)制過(guò)程中的作用初探[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

2 李治;抑癌基因Arid2對(duì)HBV病毒復(fù)制的調(diào)控及分子機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

3 王環(huán)茹;P小體相關(guān)蛋白MOV10結(jié)合于EV71基因組5’UTR并調(diào)控病毒復(fù)制[D];南京大學(xué);2016年

4 董春艷;miR-9與MCPIP1互作對(duì)流感病毒復(fù)制的影響[D];吉林大學(xué);2016年

5 喬喬;腸道病毒71型2A蛋白在病毒復(fù)制能力與毒力中的作用[D];山東大學(xué);2016年

6 韋洪晨;禽呼腸孤病毒誘導(dǎo)SPF雞的細(xì)胞自噬及其與病毒復(fù)制的關(guān)系[D];揚(yáng)州大學(xué);2016年

7 李瀅;慢性乙型肝炎病毒感染病毒復(fù)制與肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)性的初步探討[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2013年

8 李亮亮;豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5與細(xì)胞凋亡和病毒復(fù)制關(guān)系的初步研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

9 賈麗潔;ICP27特異性siRNA抑制HSV-1病毒復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];鄭州大學(xué);2010年

10 張馳;天然免疫分子Tetherin的克隆、表達(dá)及對(duì)流感病毒復(fù)制的影響[D];汕頭大學(xué);2011年

，

本文編號(hào)：1283454