本文關鍵詞：新城疫病毒M蛋白功能性氨基酸突變和M蛋白與膜聯(lián)蛋白A6互作影響病毒復制分子機制

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【摘要】：新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是副黏病毒科(Paramyxoviridaae),禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)的一個成員,為具有囊膜且含單股負鏈不分節(jié)段RNA基因組的病毒,其基因組大小約為15.1kb,至少編碼6種病毒蛋白。其中,M蛋白是含量最為豐富且高度保守的非糖基化膜相關蛋白,主要位于病毒囊膜內(nèi)表面,構成病毒內(nèi)膜與核衣殼蛋白連接的支架。同其它副黏病毒M蛋白一樣,NDV M蛋白也具有細胞核-細胞質(zhì)穿梭特性。在病毒感染早期,M蛋白主要聚集在細胞核和核仁中,并且在整個感染過程中持續(xù)存在于核仁中,其主要功能是抑制宿主細胞基因的轉錄和翻譯,并確保病毒基因組在細胞質(zhì)中有充足的時間進行復制和轉錄;而在感染后期,M蛋白進入細胞質(zhì),在細胞膜內(nèi)側能夠通過與糖蛋白的胞質(zhì)區(qū)、病毒核衣殼蛋白以及宿主細胞膜發(fā)生相互作用,以協(xié)助子代病毒粒子進行裝配和釋放。因此,M蛋白是一種多功能病毒結構蛋白,在病毒復制的過程中,尤其是在病毒的組裝和出芽釋放階段發(fā)揮著核心的作用。根據(jù)實驗室的前期工作,已經(jīng)確定了M蛋白對新城疫病毒的復制及致病性存在重要的影響。然而目前為止,對M蛋白在NDV復制過程中的作用還有諸多未知的地方。本研究旨在探索M蛋白功能性氨基酸位點突變以及M蛋白與宿主細胞蛋白相互作用影響病毒復制的分子機制為研究目的,為進一步闡明M蛋白在NDV復制中的作用奠定基礎。1.鴿副粘病毒1型M蛋白R36Q突變致弱病毒毒力及復制能力鴿副粘病毒1型(PPMV-1)是一種能夠特異性的感染宿主鴿子的病原體,通常被認為是禽副粘病毒1型(APMV-1)在鴿子上的適應性變種。有研究報道PPMV-1的這種適應性變化與病毒基因及蛋白的變化有關,但是到目前為止,這種變化與病毒的生物學特性的關系仍未見報道。M蛋白通常被認為是僅次于F和HN蛋白的毒力因子,而M蛋白在病毒感染的早期過程中發(fā)揮著重要作用。有報道M蛋白對于PPMV-1的遺傳進化及宿主適應性可能有重要作用。本研究首先對145株新城疫毒株(39株PPMV-1,106株APMV-1)進行了氨基酸序列比對分析,發(fā)現(xiàn)了 7個特異性氨基酸位點分別位于M,F,HN及L蛋白上,其中R36是位于M蛋白上的特異性氨基酸位點,同時,我們發(fā)現(xiàn)R36位點是M蛋白上的正向選擇位點;隨后我們以PPMV-1 Js/07/04/Pi(071204)株全長cDNA克隆質(zhì)粒pNDV/071204為骨架構建了 M蛋白R36Q突變的重組病毒r071204-M.R36Q,為了進行反向比較,同時構建了以表達綠色熒光蛋白的NDV ZJ1株全長cDNA克隆質(zhì)粒pNDV/ZJ1GFP為骨架構建了 M蛋白Q36R突變的重組病毒rZJ1GFP-M.Q36R。對兩株重組病毒及其母本病毒進行生物學特性測定,結果發(fā)現(xiàn),R36Q突變能夠致弱r071204在細胞和雞胚上的毒力并降低病毒復制能力,而Q36R突變對于rZJ1GFP母本病毒的各項生物學特性的影響沒有顯著差異。另外,鴿子攻毒實驗結果顯示,R36Q突變使得r071204-M.R36Q重組病毒在排毒時間及排毒量上都要顯著低于母本病毒r071204。以上結果說明PPMV-1 M蛋白的R36可能是病毒宿主適應性的一個關鍵性氨基酸位點,對PPMV-1的復制能力、致病性及傳播具有至關重要的作用。2.新城疫病毒M蛋白G275A和P276A聯(lián)合突變影響病毒的復制和出芽據(jù)報道,M蛋白在病毒感染后期在細胞膜內(nèi)側進行病毒粒子的組裝和出芽依賴于M蛋白C-端由2個α-螺旋包裹2個反向平行的β-折疊形成的特異性折疊結構與宿主細胞膜結合,后續(xù)研究推測,NDV M蛋白的275位G與鄰近的276位P形成的GP組合對M蛋白形成正確的β-折疊極為重要。本研究中,我們首先對過去的研究結果進行了驗證,通過將NDV M蛋白序列與其他副黏病毒M蛋白序列進行氨基酸比對,并結合三維結構模擬分析,我們證實NDV M蛋白C-端的LGP序列能夠發(fā)揮類似雙重氨基酸G的作用,當GP突變?yōu)锳A時,M蛋白的折疊發(fā)生了角度的變化,影響了 M蛋白功能的發(fā)揮,繼而,我們拯救了兩株突變重組病毒,分別是rZJ1GFP-M.LGP/GGL,rZJ1GFP-M.GP/AA,生物學特性測定的結果顯示,GP/AA突變重組病毒顯著降低了病毒在雞胚及細胞上的復制能力和致病性,動物致病性實驗也說明GP/AA突變造成了病毒的致弱,以上結果均說明GP序列對于病毒復制及致病性是至關重要的,此外,對重組病毒在細胞上的出芽能力進行測定,結果表明GP/AA突變后能夠大幅損傷病毒出芽能力,間接說明GP/AA突變導致的結構變化影響了病毒粒子的出芽,這也解釋了為何病毒的復制能力下降。我們的實驗結果說明M蛋白上的GP序列在NDV的生活周期中發(fā)揮了極為重要的作用。然而,仍需進一步通過結構蛋白質(zhì)組學來闡釋GP影響出芽的具體機制。3.新城疫病毒M蛋白羧基端功能結構域影響病毒的早期復制本研究對NDV ZJ1株M蛋白C-端影響二聚體矩陣形成的氨基酸進行突變,并觀察點突變對M蛋白亞細胞定位的影響,然后通過反向遺傳學技術拯救點突變病毒,進一步研究點突變對病毒復制和致病性的影響。結果顯示,M蛋白C-端D255、E258、R262、R263氨基酸單點突變以及255/258(DE)雙點突變后,不影響M蛋白細胞核和核仁定位,但是262/263(RR)、255/263、258/262雙突變后導致M蛋白由細胞核及核仁定位變?yōu)榧毎|(zhì)定位,隨后我們以表達綠色熒光蛋白的NDVZJ1株全長cDNA克隆質(zhì)粒pNDV/ZJ1GFP為骨架構建了 M蛋白相應的單點突變及雙點突變?nèi)L質(zhì)粒pNDV/ZJ1GFP-Mwt,利用反向遺傳學技術,成功拯救出8株重組病毒。生物學特性測定結果顯示,單點及雙點突變均不能導致病毒的生物學特性發(fā)生改變。然而,255/258(DE)、262/263(RR)、255/263、258/262雙突變病毒在DF1細胞中早期的增殖能力、CPE形成能力及表達GFP能力均顯著下降,說明雙突變僅僅降低了病毒的早期復制能力和致病性。我們的研究結果表明影響M蛋白二聚體矩陣形成的氨基酸位點能夠影響M蛋白的細胞核定位,并且降低病毒的早期復制能力和致病性。4.新城疫病毒M蛋白與細胞膜聯(lián)蛋白A6相互作用影響病毒的復制由于病毒編碼蛋白能力的限制,病毒不能編碼出復制所需的所有蛋白,因此,病毒往往需要利用宿主細胞蛋白或細胞結構組分來完成病毒的復制過程。本研究中我們首先通過激光共聚焦對M蛋白與宿主膜聯(lián)蛋白A6(ANXA6)蛋白在細胞中的定位情況進行了觀察,結果顯示M蛋白與ANXA6蛋白在細胞質(zhì)中存在著共定位。此后,通過免疫共沉淀技術和GST Pull-down實驗,我們進一步驗證了 M蛋白與ANXA6蛋白能夠發(fā)生互作。通過His Pull-down方法對M蛋白與ANXA6相互作用結構域進一步鑒定發(fā)現(xiàn)M蛋白aa250-280是M蛋白與ANXA6蛋白結合的區(qū)域。為了探索ANXA6蛋白與M蛋白互作對病毒復制的影響,我們設計了 RNA干擾實驗以及宿主細胞內(nèi)過表達ANXA6實驗,結果表明,抑制ANXA6蛋白表達能夠促進病毒感染細胞病變的產(chǎn)生并提高了病毒的復制效率,說明ANXA6的存在抑制了病毒的復制;另一方面,細胞內(nèi)過表達ANXA6蛋白顯著減輕了 NDV感染細胞引起的CPE并抑制了病毒的增殖,說明在細胞內(nèi)過表達ANXA6明顯降低了病毒的復制。以上結果表明,宿主ANXA6蛋白能夠負調(diào)節(jié)NDV的復制過程。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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