本文關(guān)鍵詞：SNAP-tag靶向蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記與生物應(yīng)用研究

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【摘要】：蛋白質(zhì)特異性標(biāo)記技術(shù)在生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛,其中基于蛋白質(zhì)標(biāo)簽特異性標(biāo)記小分子的方法憑借標(biāo)記的靈活性、特異性、穩(wěn)定性和分子結(jié)構(gòu)功能多樣性等特點(diǎn)獲得迅速發(fā)展,在活細(xì)胞內(nèi)靶向蛋白質(zhì)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)研究中獲得越來越多的關(guān)注。然而目前蛋白質(zhì)標(biāo)簽方法的生物學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域仍有待拓展,構(gòu)建蛋白質(zhì)特異性標(biāo)記體系并進(jìn)一步利用新型熒光功能分子實(shí)現(xiàn)特異性標(biāo)記對(duì)于相關(guān)研究具有重要意義。本文基于SNAP-tag蛋白標(biāo)簽技術(shù)設(shè)計(jì)構(gòu)建了多個(gè)亞細(xì)胞蛋白質(zhì)的靶向標(biāo)記體系,利用特異性熒光分子實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)靶向的生物檢測(cè)及蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化分析。(1)實(shí)現(xiàn)了亞細(xì)胞蛋白特異性的一氧化氮熒光檢測(cè)。利用探針TMR-NO-BG的芐基鳥嘌呤(BG)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞核、線粒體靶向及細(xì)胞彌散表達(dá)SNAP-tag的特異性共價(jià)標(biāo)記,利用鄰苯二胺的羅丹明螺環(huán)(TMR-NO)實(shí)現(xiàn)NO的高靈敏(檢測(cè)限67.3 nM)、高選擇性響應(yīng)。并成功實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)激和藥物依托泊苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中蛋白質(zhì)水平內(nèi)源NO的檢測(cè)。為NO的亞細(xì)胞功能研究提供可用的工具和方法。(2)實(shí)現(xiàn)了亞細(xì)胞定位蛋白微環(huán)境粘度的熒光檢測(cè)。利用粘度響應(yīng)熒光轉(zhuǎn)子BDP-V BG實(shí)現(xiàn)蛋白靶向SNAP-tag的高特異性標(biāo)記(53倍熒光增強(qiáng)),利用蛋白標(biāo)記轉(zhuǎn)子BDP-V-SNAP的雙光子激發(fā)熒光壽命成像實(shí)現(xiàn)三種亞細(xì)胞定位(細(xì)胞彌散、細(xì)胞核和線粒體靶向)蛋白的微環(huán)境粘度檢測(cè)(123-145 cP),并實(shí)現(xiàn)三種藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中H2B蛋白微環(huán)境粘度變化的檢測(cè)。為蛋白質(zhì)局部粘度檢測(cè)和動(dòng)力學(xué)研究提供策略。(3)實(shí)現(xiàn)了亞細(xì)胞定位蛋白的特異性雙光子熒光成像。利用萘酰亞胺衍生物TNI-BG、QNI-BG和ONI-BG實(shí)現(xiàn)了體外純化與細(xì)菌內(nèi)SNAP-tag蛋白的特異性標(biāo)記,真核細(xì)胞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明,雙光子性能良好的ONI-BG(吸收截面128 GM)可實(shí)現(xiàn)多種亞細(xì)胞定位SNAP-tag蛋白標(biāo)簽的特異性標(biāo)記與雙光子成像。這一策略為雙光子成像技術(shù)在蛋白質(zhì)特異性標(biāo)記中的應(yīng)用提供方法。(4)構(gòu)建了基于綠色熒光蛋白EGFP串聯(lián)SNAP-tag蛋白脈沖標(biāo)記染料TMR-BG的熒光比率成像體系。分別利用過氧化物酶體信號(hào)肽PTS1、自噬相關(guān)蛋白LC3B和組蛋白H2B構(gòu)建EGFP-SNAP雙標(biāo)簽體系,利用EGFP的綠色熒光為參比,對(duì)脈沖標(biāo)記的TMR紅色熒光進(jìn)行比率成像。實(shí)現(xiàn)了過氧化物酶體周轉(zhuǎn)代謝過程的比率成像分析和自噬形成過程動(dòng)態(tài)變化的熒光分析,同時(shí)利用這一雙標(biāo)簽體系的比率成像分析評(píng)價(jià)了不同條件下組蛋白H2B的周轉(zhuǎn)代謝調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q503;O657.3

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1 王超;SNAP-tag靶向蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記與生物應(yīng)用研究[D];大連理工大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：1280166