本文關(guān)鍵詞：基于PGC-1α的外周生物時(shí)鐘和能量代謝整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)制研究

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【摘要】：地球的自轉(zhuǎn)產(chǎn)生了晝夜交替循環(huán),為了適應(yīng)這—環(huán)境變化,哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)化出生物時(shí)鐘系統(tǒng),控制著各項(xiàng)生理進(jìn)程,如睡眠周期、血壓、血液激素水平及能量代謝等,使之呈現(xiàn)出以24小時(shí)(hours, h)為周期的節(jié)律性變化。哺乳動(dòng)物的生物時(shí)鐘主要可分為中樞性生物時(shí)鐘和外周性生物時(shí)鐘兩類。中樞性生物時(shí)鐘位于下丘腦視交叉上核神經(jīng)元(hypothalamus suprachiasmatic nucleus, SCN),它能整合外界環(huán)境中的光/非光信號(hào),產(chǎn)生節(jié)律性輸出,經(jīng)神經(jīng)內(nèi)分泌和體液循環(huán)通路,影響外周組織的生理進(jìn)程,同時(shí)協(xié)調(diào)外周性生物鐘。通常情況下,中樞和外周生物時(shí)鐘的運(yùn)作是同步偶聯(lián)的,使得機(jī)體能量利用率達(dá)到最優(yōu)狀態(tài),以適應(yīng)外界光線和進(jìn)食周期等環(huán)境因素的改變。近年來(lái)研究證實(shí),神經(jīng)內(nèi)分泌和代謝系統(tǒng)受到時(shí)鐘節(jié)律的精確調(diào)控。哺乳動(dòng)物體內(nèi),約43%的基因呈現(xiàn)出晝夜節(jié)律性表達(dá),其中有許多基因負(fù)責(zé)編碼在代謝過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄輔因子/因子和酶類,因此導(dǎo)致體內(nèi)多種代謝進(jìn)程(比如肝糖異生,膽酸合成等)也呈現(xiàn)出晝夜節(jié)律性。而且,許多核心生物時(shí)鐘基因(如Bmall、RORa等)自身具有重要的代謝調(diào)控功能。相反,營(yíng)養(yǎng)信號(hào)的改變,如高脂飲食,可以重設(shè)機(jī)體外周性生物時(shí)鐘,使得外周性生物時(shí)鐘與中樞性生物時(shí)鐘解偶聯(lián),從而導(dǎo)致一系列代謝性疾病的發(fā)生。因此,生物時(shí)鐘和能量代謝之間存在著緊密聯(lián)系,這兩者的整合機(jī)制目前已得到部分闡明。簡(jiǎn)而言之,目前公認(rèn)的整合模式有兩種：a.以核受體、代謝物、轉(zhuǎn)錄輔因子/因子等為節(jié)點(diǎn),同時(shí)調(diào)控時(shí)鐘和能量代謝進(jìn)程,促使二者的整合,即“并聯(lián)型”整合模式；b.鐘控基因(clock-controlled genes, CCGs)承接生物鐘信號(hào),并作為下游效應(yīng)器進(jìn)而調(diào)控代謝進(jìn)程,線性化促使二者整合,即“串聯(lián)型”整合模式。值得一提的是,過(guò)氧化物酶體增殖子活化受體γ共激活因子-1α (peroxisome proliferator activated receptor y coactivator 1α, PGC-1α)作為一個(gè)重要的能量代謝調(diào)控因子,能以“并聯(lián)型”整合模式,協(xié)同調(diào)控肝臟的生物時(shí)鐘與能量代謝進(jìn)程。PGC-1α的表達(dá)高度受控于環(huán)境刺激和營(yíng)養(yǎng)信號(hào),一旦被誘導(dǎo),它就能夠和多種核轉(zhuǎn)錄因子(如PPARα/β/γ/δ、ERRα/β/γ、HNF4α等)相互作用,激活下游的多種代謝通路,包括促進(jìn)線粒體增殖和褐色脂肪組織的適應(yīng)性產(chǎn)熱、饑餓時(shí)的肝糖異生等,從而使生物體對(duì)外界刺激信號(hào)作出靈敏的反應(yīng)。然而,PGC-1α是一個(gè)位處相對(duì)上游的樞紐分子,對(duì)PGC-1α進(jìn)行調(diào)控會(huì)產(chǎn)生“牽一發(fā)而動(dòng)全身”的效果,其調(diào)控的特異性和安全性大打折扣。有鑒于此,我們需要尋找PGC-1α的分子伴侶或受PGC-1α調(diào)控的下游分子,闡明它們的組織特異性的時(shí)鐘和代謝調(diào)控功能,從而實(shí)現(xiàn)更加高效地調(diào)控。為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo),本研究以PGC-1α為基點(diǎn),篩選出其分子伴侶Smarcd1和其下游基因Vanin-1 (VNN1),并深入研究了它們的時(shí)鐘和代謝整合功能。研究分為兩部分,第一部分主要探究Smarcd1在整合血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMCs)生物時(shí)鐘和生理穩(wěn)態(tài)過(guò)程中所起的作用；第二部分旨在闡明VNN1在承接時(shí)鐘信號(hào),進(jìn)而調(diào)控肝臟糖異生過(guò)程中所扮演的角色。我們的研究發(fā)現(xiàn)Smarcd1在大鼠VSMCs中呈現(xiàn)出振蕩性表達(dá),其表達(dá)振幅被體內(nèi)高脂飲食(high fat diet, HFD)信號(hào)以及體外游離脂肪酸(free fatty acids, FFAs)刺激所抑制。分子水平實(shí)驗(yàn)證實(shí),Smarcd1與RORa結(jié)合,協(xié)同激活bmall啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,且二者的結(jié)合由PGC-1α所介導(dǎo)。在VSMCs的生理功能方面,我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Smarcd1,能夠顯著抑制FFAs所誘導(dǎo)的VSMCs增殖、遷移及黏附,同時(shí)抑制Erk/MAPK以及Akt磷酸化水平。并且,Smarcd1的這些效應(yīng)會(huì)被Bmall的敲降所減弱。綜上所述,Smarcd1在協(xié)同調(diào)節(jié)VSMCs的生物時(shí)鐘和生理功能穩(wěn)態(tài)方面扮演著重要的角色。另一方面,PGC-1α下游基因VNN1能夠響應(yīng)時(shí)鐘信號(hào),在小鼠肝臟中呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá)。代謝方面,在饑餓或者胰島素(Insulin)抵抗的小鼠肝臟中,VNN1的表達(dá)顯著升高。過(guò)表達(dá)VNNl能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Insulin/Akt信號(hào)通路,提高糖異生基因表達(dá)和肝臟葡萄糖生成,導(dǎo)致高血糖癥狀的出現(xiàn)。在分子水平上,PGC-1α和HNF4a協(xié)同激活vnnl的轉(zhuǎn)錄。ChIP實(shí)驗(yàn)表明PGC-1α錨定在vnnl近端啟動(dòng)子的HNF4a結(jié)合位點(diǎn)附近,并且使染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)入活躍狀態(tài)。由此可見(jiàn),VNN1能響應(yīng)時(shí)鐘信號(hào),并作為下游效應(yīng)器調(diào)節(jié)肝臟糖異生過(guò)程。一言以蔽之,本研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α分子伴侶Smarcd1以“并聯(lián)型”模式整合VSMCs的生物時(shí)鐘和生理穩(wěn)態(tài)；PGC-1α下游基因VNN1以“串聯(lián)型”模式,響應(yīng)時(shí)鐘信號(hào),進(jìn)而調(diào)控肝臟糖異生過(guò)程。本研究豐富了現(xiàn)有的生物時(shí)鐘和能量代謝之間的整合理論,同時(shí)從時(shí)間生物學(xué)角度為治療代謝性疾病提供了更加有效的藥物作用靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：生物時(shí)鐘 能量代謝穩(wěn)態(tài) PGC-1α Smarcd1 VNN1 血管平滑肌細(xì)胞 肝臟
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q418;Q78
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 第1章 緒論12-25
• 1.1 生物時(shí)鐘的運(yùn)作12-13
• 1.2 生物時(shí)鐘的分子機(jī)制13-14
• 1.3 生物時(shí)鐘與能量代謝進(jìn)程14-19
• 1.3.2 生物時(shí)鐘與葡萄糖穩(wěn)態(tài)17-18
• 1.3.3 生物時(shí)鐘與脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)18-19
• 1.3.4 時(shí)鐘定時(shí)器與能量代謝穩(wěn)態(tài)19
• 1.4 生物時(shí)鐘和能量代謝的整合機(jī)制19-23
• 1.4.1 核受體整合機(jī)制19-20
• 1.4.2 代謝物整合機(jī)制20-21
• 1.4.3 轉(zhuǎn)錄共激活因子整合機(jī)制21-22
• 1.4.4 染色質(zhì)重塑復(fù)合物整合機(jī)制22-23
• 1.5 本章小結(jié)23-25
• 第2章 PGC-1α分子伴侶Smarcd1整合VSMCs生物時(shí)鐘和生理進(jìn)程的機(jī)制研究25-77
• 2.1 引言25-28
• 2.2 材料與方法28-53
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料28
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理28-30
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法30-52
• 2.2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)52-53
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-75
• 2.3.1 大鼠胸主動(dòng)脈中Smarcd1的表達(dá)分布53
• 2.3.2 高血脂大鼠模型的構(gòu)建53-54
• 2.3.3 高血脂抑制CT大鼠VSMCs中Smarcd1和生物鐘基因的表達(dá)54-55
• 2.3.4 高血脂抑制ZT大鼠VSMCs中Smarcd1和生物鐘基因的表達(dá)55-56
• 2.3.5 HFD抑制CT小鼠VSMCs中Smarcd1和生物鐘基因Bmal1的表達(dá)56-57
• 2.3.6 FFAs劑量依賴性地抑制VSMCs中Smarcd1和生物鐘基因的表達(dá)57-58
• 2.3.7 FFAs時(shí)間依賴性地抑制VSMCs中Smarcd1和生物鐘基因的表達(dá)58-59
• 2.3.8 Smarcd1激活VSMCs中生物鐘基因表達(dá)59-60
• 2.3.9 Smarcd1調(diào)控VSMCs中生物鐘基因節(jié)律性表達(dá)60-61
• 2.3.10 Smarcd1和RORα協(xié)同激活bmal1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄61-62
• 2.3.11 PGC-1α介導(dǎo)Smarcd1對(duì)于VSMCs生物鐘的調(diào)控62-64
• 2.3.12 Bmal1全身敲除小鼠基因型鑒定64-65
• 2.3.13 HFD導(dǎo)致Bmal1敲除小鼠發(fā)生高血脂癥65
• 2.3.14 HFD喂養(yǎng)的Bmal1敲除小鼠VSMCs異常活化65-66
• 2.3.15 Smarcd1過(guò)表達(dá)及Bmal1干擾效率的驗(yàn)證66-67
• 2.3.16 Smarcd1抑制FFAs誘導(dǎo)的VSMCs增殖67-68
• 2.3.17 Smarcd1并未影響VSMCs的凋亡68
• 2.3.18 Smarcd1負(fù)向調(diào)控VSMCs的細(xì)胞周期68-69
• 2.3.19 Smarcd1抑制FFAs誘導(dǎo)的VSMCs的遷移69-70
• 2.3.20 Smarcd1抑制FFAs導(dǎo)致的VSMCs粘附相關(guān)蛋白的活化70-71
• 2.3.21 Smarcd1是維持VSMCs生理功能基因時(shí)鐘振蕩表達(dá)的關(guān)鍵因子71-72
• 2.3.22 Smarcd1抑制FFAs導(dǎo)致的VSMCs激酶的蛋白活化72-73
• 2.3.23 Smarcd1抑制FFAs導(dǎo)致的VSMCs中ROS的產(chǎn)生73
• 2.3.24 Smarcd1減少FFAs導(dǎo)致的VSMCs中脂質(zhì)堆積73-74
• 2.3.25 Bmal1能調(diào)控Smarcd1的表達(dá)74-75
• 2.4 討論與展望75-77
• 第3章 PGC-1α下游分子VNN1響應(yīng)外周生物時(shí)鐘并調(diào)控肝臟糖異生進(jìn)程的機(jī)制研究77-115
• 3.1 引言77-80
• 3.2 材料與方法80-90
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料80
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理80-81
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)方法81-89
• 3.2.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)89-90
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果90-111
• 3.3.1 VNN1在小鼠肝臟中呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá)90-91
• 3.3.2 生理性糖異生信號(hào)激活小鼠肝臟中VNN1的表達(dá)91-92
• 3.3.3 病理性糖異生信號(hào)激活小鼠肝臟中VNN1的表達(dá)92-94
• 3.3.4 糖異生信號(hào)對(duì)VNN3的表達(dá)的影響94
• 3.3.5 體外糖異生信號(hào)8-Br cAMP激活VNN1的表達(dá)94-95
• 3.3.6 VNN1激活小鼠肝臟糖異生進(jìn)程95-96
• 3.3.7 VNN1在細(xì)胞水平上激活糖異生作用96-97
• 3.3.8 肝臟特異性干擾VNN1導(dǎo)致正常小鼠饑餓低血糖并抑制糖異生基因的表達(dá)97-98
• 3.3.9 肝臟特異性干擾VNN1改善db/db小鼠高血糖及過(guò)度糖異生進(jìn)程98-100
• 3.3.10 肝臟特異性干擾VNN3不能緩解db/db小鼠高血糖和過(guò)度糖異生進(jìn)程100-101
• 3.3.11 細(xì)胞水平上干擾VNN1降低8-Br cAMP導(dǎo)致的糖異生基因活化101-102
• 3.3.12 VNN1負(fù)向調(diào)控Insulin/Akt信號(hào)通路102-104
• 3.3.13 Akt信號(hào)通路介導(dǎo)VNN1對(duì)于糖異生過(guò)程的調(diào)控作用104
• 3.3.14 PPARγ信號(hào)可能介導(dǎo)VNN1對(duì)Akt信號(hào)的調(diào)控作用104-105
• 3.3.15 PGC-1α在動(dòng)物水平上激活VNN1的表達(dá)105-106
• 3.3.16 PGC-1α在細(xì)胞水平上激活VNN1的表達(dá)106-107
• 3.3.17 PGC-1α協(xié)同HNF4α激活vnn1的轉(zhuǎn)錄107-109
• 3.3.18 HNF4α介導(dǎo)PGC-1α對(duì)VNN1的正向調(diào)控作用109
• 3.3.19 VNN1是PGC-1α的輸出基因109-111
• 3.4 討論與展望111-115
• 第4章 全文總結(jié)115-117
• 4.1 本研究的主要研究成果和結(jié)論115
• 4.1.1 PGC-1α分子伴侶Smarcd1整合VSMCs生物時(shí)鐘和生理穩(wěn)態(tài)進(jìn)程115
• 4.1.2 PGC-1α下游基因VNN1響應(yīng)外周生物時(shí)鐘并調(diào)控肝臟糖異生過(guò)程115
• 4.2 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)115-116
• 4.3 進(jìn)一步研究方向116-117
• 附錄117-126
• 參考文獻(xiàn)126-147
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果147-149
• 致謝149

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1101787