本文關(guān)鍵詞：基于SMRT測序技術(shù)的藥用植物遺傳序列研究

  更多相關(guān)文章： 單分子實時DNA測序 藥用植物 基因組 葉綠體 轉(zhuǎn)錄組

【摘要】：我國藥用植物資源豐富,但由于種類繁多且遺傳背景復(fù)雜等原因,藥用植物的基因組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究難度較大,目前整體尚處于起步階段,先進測序技術(shù)和分析手段應(yīng)用的欠缺是導(dǎo)致這一現(xiàn)狀的重要因素。單分子實時(single molecule real-time, SMRT)DNA測序技術(shù),是通過大規(guī)模實時記錄單個DNA聚合酶在零模波導(dǎo)(zero-mode waveguide, ZMW)納米孔中以樣品DNA為復(fù)制模板催化DNA合成的過程,獲得樣品DNA堿基序列信息的高通量DNA測序技術(shù)。在DNA測序技術(shù)的發(fā)展歷史中,SMRT屬于第三代,也是目前世界上最先進的DNA測序技術(shù),自2009年問世以來,助力解決了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域諸多重要問題。SMRT的技術(shù)原理對解決高通量測序時代藥用植物學(xué)研究領(lǐng)域的一些關(guān)鍵問題具有顯著優(yōu)勢,但相關(guān)研究尚屬空白。本文以重要藥用植物以及藥用真菌為例,進行了基于SMRT測序技術(shù)的藥用植物基因組混合組裝、葉綠體全基因組序列組裝、全長轉(zhuǎn)錄本測序的實驗研究�；蚪M序列是進行藥用植物系統(tǒng)生物學(xué)研究的基礎(chǔ),本研究的第一部分以模式藥用植物丹參(Salvia miltiorrhiza)為例,應(yīng)用SMRT測序技術(shù)對丹參的基因組長片段(8-10kb)隨機打斷文庫進行測序。實驗中所使用的二倍體丹參預(yù)測的基因組大小約為615Mb,基因組構(gòu)成復(fù)雜,本研究在已有下一代測序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,引入約4Gb長度大于2000bp的矯正過的long reads(來自約8GB的SMRT測序數(shù)據(jù)),并采取基于long reads的混合拼接策略進行組裝。獲得了60,349個contig,平均contig長度為8.69kb,contig的N50長度為12.4kb,序列總長度為524 Mb,覆蓋85%預(yù)測到的丹參基因組。加入mate-pair數(shù)據(jù)后,得到21,045條scaffold,平均scaffold長度為25.56kb,scaffold的N50長度為51.02kb,最長scaffold為388.31kb,序列總長度為538Mb, BAC文庫的測序結(jié)果驗證了序列與組裝的準(zhǔn)確性。與已有的Ilumina、454單獨拼接的結(jié)果進行比較,原碎片化的拼接結(jié)果得到大幅度改善,并應(yīng)用于后續(xù)丹參酚酸生物合成基因的挖掘與分析,證明SMRT測序技術(shù)的介入可以顯著提高復(fù)雜藥用植物基因組的拼接質(zhì)量。葉綠體基因組序列是藥用植物超級條形碼(super-barcode)鑒定的研究基礎(chǔ),也是研究葉綠體基因工程、葉綠體序列分子標(biāo)記開發(fā)以及植物系統(tǒng)發(fā)育研究的重要數(shù)據(jù)來源。本研究的第二部分內(nèi)容是以貝母屬三種藥用植物湖北貝母(Fritillaria hupehensis)、太白貝母(Fritillaria taipaiensis)和卷葉貝母(Fritillaria cirrhosa)為例,分別于群落中采集多個植株的葉片進行混合,構(gòu)建短片段插入文庫進行基于環(huán)狀一致測序策略(circular consensus sequencing, CCS)的SMRT測序,全程無PCR引入,在不使用參考基因組的前提下拼接得到了每個物種的葉綠體全基因組一致序列,經(jīng)Sanger測序驗證了測序和拼接的準(zhǔn)確度為100%,且驗證序列中變異頻率低于15%的單核苷酸多態(tài)性位點(single nucleotide polymorphism, SNP)均得到了驗證。葉綠體基因組序列分析顯示,三種貝母屬藥用植物的葉綠體基因組均呈典型的四分體結(jié)構(gòu),長度在151,691bp至152,145bp范圍內(nèi),編碼135個基因,8個rRNA基因,38個tRNA基因,18個基因含有內(nèi)含子,infA、ycf15和ycf68基因中間發(fā)現(xiàn)終止密碼子,在貝母中可能是假基因。其中太白貝母葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)了20個SNP位點,變異頻率在9.38%-45.45%之間；卷葉貝母葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)了70個SNP位點,變異頻率在9.60%-50.00%之間,提示了川貝母群落可能存在的SNPs分布特征。此外,本研究也通過比較基因組的研究手段,對貝母屬藥用植物超級條形碼的相關(guān)研究進行了有益的探索,物種間的葉綠體基因組序列比較分析給出了種間變異較大的基因,基于葉綠體基因組序列的百合目系統(tǒng)進化分析給出了黑藥花科(Melanthiaceae)更接近于百合目基部的新證據(jù)。研究結(jié)果顯示,SMRT-CCS策略在藥用植物葉綠體基因組全序列獲取上具有巨大優(yōu)勢和普遍推廣意義。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是研究藥用植物功能基因、次生代謝調(diào)控機制的重要基礎(chǔ)。本研究的第三部分以本課題組已發(fā)布基因組數(shù)據(jù)的藥用真菌靈芝(Ganoderma lucidum)為研究對象,設(shè)計總mRNA均一化后分片段構(gòu)建文庫的策略,使用SMRT測序技術(shù)直接對反轉(zhuǎn)錄得到的靈芝子實體期全長cDNA進行測序,并以靈芝P450基因家族進行生物信息學(xué)驗證,結(jié)果顯示本方案的轉(zhuǎn)錄組覆蓋度良好,具有較強的全長轉(zhuǎn)錄本測序能力,克服了已有的高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)無法直接從5’到3’完整描述RNA信息從而真實地反應(yīng)RNA異構(gòu)體信息的弊端,并提示靈芝轉(zhuǎn)錄組中大量可變剪接現(xiàn)象的存在。分析結(jié)果也反映出,在SMRT測序技術(shù)的現(xiàn)有能力下,全長轉(zhuǎn)錄本的序列準(zhǔn)確性需要進一步提高以適應(yīng)后續(xù)分析。綜上所述,本文以重要藥用植物和藥用真菌為例,進行了基于SMRT測序技術(shù)的藥用植物基因組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的開創(chuàng)性研究,分別提出了行之有效的實驗策略與分析方法�？傊�,SMRT測序技術(shù)在藥用植物學(xué)研究領(lǐng)域具有重要價值和巨大的應(yīng)用潛力,有助于推動我國傳統(tǒng)藥學(xué)進入生命科學(xué)研究前沿領(lǐng)域,在藥用植物優(yōu)良品種選育、藥用植物分子鑒定和次生代謝產(chǎn)物合成路徑解析等方面產(chǎn)生巨大影響。
【關(guān)鍵詞】：單分子實時DNA測序 藥用植物 基因組 葉綠體 轉(zhuǎn)錄組
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R282.71
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 第一章 前言11-34
• 1.1 SMRT測序技術(shù)概述12-20
• 1.1.1 技術(shù)原理12-14
• 1.1.2 技術(shù)優(yōu)勢14-17
• 1.1.3 重要應(yīng)用領(lǐng)域17-20
• 1.2 植物基因組DE NOVO組裝策略概述20-25
• 1.2.1 測序前期工作22-23
• 1.2.2 測序策略23-24
• 1.2.3 組裝策略24-25
• 1.3 葉綠體基因組研究概述25-31
• 1.3.1 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特點25-28
• 1.3.2 基于葉綠體基因組序列的植物DNA條形碼研究28-31
• 1.4 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)概述31-34
• 第二章 可行性分析與研究意義34-44
• 2.1 SMRT測序技術(shù)輔助復(fù)雜植物基因組組裝研究34-37
• 2.2 基于SMRT-CCS策略的貝母葉綠體基因組研究37-39
• 2.3 基于SMRT測序技術(shù)的靈芝全長轉(zhuǎn)錄本研究39-44
• 第三章 研究材料與方法44-72
• 3.1 材料、試劑與設(shè)備44-47
• 3.1.1 材料44-45
• 3.1.2 試劑45-46
• 3.1.3 設(shè)備46-47
• 3.2 方法47-72
• 3.2.1 丹參總DNA提取47-48
• 3.2.2 貝母葉綠體分離及葉綠體基因組DNA提取48-49
• 3.2.3 靈芝子實體總RNA提取,cDNA合成與均一化,片段篩選49-57
• 3.2.4 SMRT短片段(500bp-3kb)文庫構(gòu)建與上機測序57-62
• 3.2.5 SMRT長片段(3kb-10kb)文庫構(gòu)建與上機測序62-66
• 3.2.6 序列拼接與分析66-72
• 第四章 結(jié)果與分析72-96
• 4.1 丹參基因組SMRT測序及輔助組裝72-75
• 4.1.1 丹參基因組SMRT測序72
• 4.1.2 SMRT CLR輔助丹參基因組組裝與驗證72-75
• 4.2 貝母葉綠體基因組分析75-89
• 4.2.1 貝母屬三種藥用植物葉綠體基因組測序75-78
• 4.2.2 貝母屬三種藥用植物葉綠體基因組基本特征78-83
• 4.2.3 貝母屬三種藥用植物葉綠體基因組比較83-84
• 4.2.4 百合目葉綠體基因組序列比較84-87
• 4.2.5 測序拼接策略與準(zhǔn)確度驗證87-89
• 4.3 靈芝子實體全長轉(zhuǎn)錄本分析結(jié)果89-96
• 4.3.1 靈芝子實體總RNA質(zhì)控結(jié)果90-91
• 4.3.2 靈芝子實體SMRT測序數(shù)據(jù)91-93
• 4.3.3 靈芝子實體全長轉(zhuǎn)錄本鑒別93-94
• 4.3.4 靈芝子實體全長轉(zhuǎn)錄本cluster94-95
• 4.3.5 生物信息學(xué)驗證95-96
• 第五章 討論與結(jié)論96-103
• 5.1 丹參基因組組裝研究96-98
• 5.2 基于SMRT-CCS策略的藥用植物綠體基因組研究98-101
• 5.3 基于SMRT測序技術(shù)的靈芝子實體全長轉(zhuǎn)錄本分析101-103
• 第六章 展望103-105
• 參考文獻105-119
• 附錄119-136
• 后記136-138
• 作者簡歷138-139

【參考文獻】

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本文編號：1101770