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核糖開關(guān)的閾值進(jìn)化及其在N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用

發(fā)布時(shí)間:2024-12-15 22:06
  N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)是一種常見的唾液酸,在自然界中廣泛存在,可以用于合成其他唾液酸或者唾液酸的衍生物。同其他唾液酸一樣,NeuAc主要存在于糖鏈的末端,對細(xì)胞的生物識別具有重要作用。此外,NeuAc本身還可以作為保健食品和藥品,具有較高的商業(yè)價(jià)值。目前,NeuAc的生產(chǎn)和提取獲得方式存在諸多問題,因此使用葡萄糖等廉價(jià)碳源,在不添加任何前體的情況下來生產(chǎn)NeuAc具有許多優(yōu)勢。目前已有的微生物發(fā)酵生產(chǎn)NeuAc方法產(chǎn)量較低,不適合大規(guī)模的應(yīng)用。同時(shí),在發(fā)酵過程中有大量的乙酰葡萄糖胺和乙酰甘露糖胺積累。根據(jù)代謝特征分析,我們推測NeuAc生產(chǎn)的限速酶為乙酰葡萄糖胺-2-異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸合酶。因此選擇了目前報(bào)道的酶活最高的兩種乙酰葡萄糖胺-2-異構(gòu)酶和三種神經(jīng)氨酸合酶進(jìn)行組合和搖瓶發(fā)酵。使用Agea和NeuBc替換PB后的質(zhì)粒NeuAc產(chǎn)量提高了 1.5倍,證明了 Age和NeuB確實(shí)是NeuAc生產(chǎn)途徑的關(guān)鍵酶。除了酶的來源以外,酶的表達(dá)強(qiáng)度對產(chǎn)量也有較大影響。因此在更換關(guān)鍵酶的基礎(chǔ)上,我們對酶的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行了優(yōu)化,使得NeuAc產(chǎn)量提高了 1.2倍。而繼續(xù)增強(qiáng)表達(dá)強(qiáng)度沒有...

【文章頁數(shù)】:120 頁

【學(xué)位級別】:博士

【部分圖文】:

圖1-1?NeuAc的分子結(jié)構(gòu)??Figure?1-1?Molecular?structure?of?NeuAc??在藥用價(jià)值方面,NeuAc是重要的藥物前體M

圖1-1?NeuAc的分子結(jié)構(gòu)??Figure?1-1?Molecular?structure?of?NeuAc??在藥用價(jià)值方面,NeuAc是重要的藥物前體M

醇[3]。唾液酸??是一類帶負(fù)電荷的糖類,它們衍生自2-酮-3-脫氧-D-甘油-D-半乳糖-壬酸(KDN),??共有九個(gè)碳原子骨架。迄今為止,己經(jīng)鑒定出50多種唾液酸,在人類和其他哺??乳動物中,N-乙酰胺基祌經(jīng)氨酸(NeuAc)是主要的唾液酸,在生物學(xué),病理學(xué)??和免疫識別過程....


圖2-1大腸桿菌NeuAc生產(chǎn)途徑??Figure?2-1?Pathway?of?NeuAc?production?in^".?coll??我們首先考慮提S?Age和NeuB的酶活

圖2-1大腸桿菌NeuAc生產(chǎn)途徑??Figure?2-1?Pathway?of?NeuAc?production?in^".?coll??我們首先考慮提S?Age和NeuB的酶活

在此基礎(chǔ)上敲除NeuAc降解基因操??縱子和乙釀葡萄糖胺的降解基因操縱子,使得NeuAc產(chǎn)量進(jìn)一步提高。將??產(chǎn)生乙酸和乳酸的副產(chǎn)物途徑敲除后NeuAc產(chǎn)量達(dá)到了?7.1?g/L。然而神經(jīng)氨酸??醛縮酶NanA催化的是一個(gè)可逆反應(yīng),這就阻礙了?NeuAc的積累。我們將神經(jīng)??氨酸....


圖2-5?pBac與pBbc的分批發(fā)酵產(chǎn)物對比??Figure?2-5?Comparison?of?batch?fermentation?products?of?pBac?and?pBbc??39??

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山東大學(xué)博士學(xué)位論文??我們也嘗試了引入來自空腸彎曲桿菌的UDP-GlcNAc-2-異構(gòu)酶NeuC,使得??GlcN-6P可以經(jīng)過UDP-GlcNAc去往NeuAc?(圖2-3),將該質(zhì)粒命名為pBacc。??然而結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一支路的引入并沒有使NeuAc產(chǎn)量增加(圖2-4)。可能....


圖2-6?DN5/pBac搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果??Figure?2-6?Fermentation?results?of?DN5/pBac?shaker?feed??

圖2-6?DN5/pBac搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果??Figure?2-6?Fermentation?results?of?DN5/pBac?shaker?feed??

對DN5/pBac進(jìn)行了搖瓶分批補(bǔ)料發(fā)酵,經(jīng)過72小時(shí)的發(fā)酵,NeuAc產(chǎn)量不??再增加,此時(shí)積累了?5.4g/L的NeuAc?(圖2-6)。在發(fā)酵過程中,有大量GlcNAc??的積累,而ManNAc也有少量積累。我們推測,GlcNAc和ManNAc的積累仍然??會影響NeuAc....



本文編號:4016537

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