本文關(guān)鍵詞：透明顫菌血紅蛋白及其突變體蛋白對芳香族污染物清除作用的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著社會經(jīng)濟和生產(chǎn)力的不斷發(fā)展,工業(yè)三廢的無節(jié)制排放、粉塵和酸雨的侵蝕、化肥農(nóng)藥殺蟲劑的大量施用等,大量的污染物被排放到空氣、土壤和水中。但是,自然界對這些污染物的降解能力有限,水中的芳香族化合物及有機營養(yǎng)物的增多,導(dǎo)致水生動物變異,滅絕。我國野生動物生境中苯系物的污染非常廣泛,對水生生境中的野生動物造成了嚴重的危害。目前,對水污染的處理主要可分為三類：物理法、化學法和生物法,生物法又包括微生物法和生物酶法。國內(nèi)使用生物酶法清除苯系物的研究尚處于起步階段。生物酶法是利用酶的催化作用來加速清除有機物的方法,過氧化物酶類就是生物酶法中的一種能清除水中污染的酶。2002年Bhunia等發(fā)現(xiàn),染料對辣根過氧化物酶的抑制作用導(dǎo)致天然過氧化物酶對亞甲基蘭及苯酚的清除速率較低。如何解決這一問題呢?這在酶來源上對我們提出了挑戰(zhàn)。透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)是一個來源于專性好氧的Vitreoscilla中的細菌球蛋白。近期研究發(fā)現(xiàn)它具有類過氧化物酶活力,透明顫菌血紅蛋白可以催化各種芳香族類的底物。因此透明顫菌血紅蛋白作為類過氧化物酶在水污染治理中具有很大的應(yīng)用潛力。為此,開展了下述實驗研究：1.將含有透明顫菌血紅蛋白質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在低氧條件下進行表達。SDS-凝膠電泳在14.3KD左右的電泳亮帶表明透明顫菌血紅蛋白己被成功表達。細胞破碎液經(jīng)過硫酸銨沉淀、離子交換層析、分子篩柱層析等純化步驟后,制備的透明顫菌血紅蛋白的紫外特征吸收峰在402nm及280nm處,Rz值大于3.0。將得到的透明顫菌血紅蛋白通過鐵氰化鉀氧化,進行全氧化態(tài)的制備,紫外吸收光譜證實了上述樣品的全氧化態(tài)。2.為探索透明顫菌血紅蛋白不同突變體對苯系物污染物(不同底物)的選擇性和清除效率,進一步設(shè)計了透明顫菌血紅蛋白突變體Q53H, P54C, Q53H/P54C并純化制備了相應(yīng)的蛋白。差熱分析等實驗表明,透明顫菌血紅蛋白突變體Q53H/P54C蛋白的熔化溫度(熱穩(wěn)定性)高于辣根過氧化物酶、透明顫菌血紅蛋白和透明顫菌血紅蛋白突變體(Q53H、P54C)蛋白。3.鑒于亞甲基蘭是紡織工業(yè)廢水中常見的污染物質(zhì),為此我們優(yōu)化了透明顫菌血紅蛋白及其突變體蛋白(Q53H, P54C, Q53H/P54C)在不同PH、溫度和H202濃度下的亞甲基蘭清除效率。結(jié)果表明：在pH 7.5, H2O2 7.5 mM的條件下,透明顫菌血紅蛋白清除亞甲基蘭的效率比辣根過氧化物酶高5.7倍,而透明顫菌血紅蛋白突變體Q53H/P54C對亞甲基蘭的清除率比透明顫菌血紅蛋白高1.4倍；與辣根過氧化物酶相比較,透明顫菌血紅蛋白突變體Q53H/P54C具有更好的熱穩(wěn)定性、更佳的pH穩(wěn)定性和H202抗性。認為經(jīng)定點突變后透明顫菌血紅蛋白突變體清除效率的增高暗示著將透明顫菌血紅蛋白遠端口袋E7位置的谷氨酰胺替換為組氨酸后,引入的組氨酸將導(dǎo)致螺旋含量的增加,這將導(dǎo)致組氨酸被推向血紅素平面,使得卟啉周圍的結(jié)構(gòu)更靠近反應(yīng)部位。4.苯胺、三氯苯胺、苯酚、三氯苯酚是苯系物中有代表性的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類生活污染的排放物。針對不同的底物,在優(yōu)化最適pH及最適溫度的基礎(chǔ)上,比較透明顫菌血紅蛋白及其突變體Q53H, P54C, Q53H/P54C對不同苯系物清除效率上的差異。實驗結(jié)果表明：在以苯胺、2,4,5-三氯苯胺、苯酚為底物時,透明顫菌血紅蛋白突變體Q53H表現(xiàn)出最高的清除效率；在以三氯苯酚為底物時,透明顫菌血紅蛋白突變體P54C表現(xiàn)出最高的清除效率。說明透明顫菌血紅蛋白遠端口袋位置經(jīng)分子改造后,能改善其對不同苯系物底物的選擇性。在處理含有苯系物的污水時,可針對不同的底物,選用清除效率最佳的突變體進行治理。綜上所述,本研究在分子水平上對透明顫菌血紅蛋白及其突變體P54C, Q53H, Q53H/P54C蛋白對動物生境中的可能污染物亞甲基蘭,芳香族有機化合物苯酚、苯胺、2,4,5-三氯苯胺和2,4,6-三氯苯酚的清除作用進行了探索。通過定點突變的技術(shù),改變了透明顫菌血紅蛋白血卟啉周圍的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象,這一變化可能改變配基對血卟啉的親和力,從而改善透明顫菌血紅蛋白對底物的催化活力。獲得了對亞甲基蘭具有更高清除效率的Q53H/P54C突變體,對苯酚、苯胺、2,4,5-三氯苯胺具有更高清除效率的Q53H突變體,以及對2,4,6-三氯苯酚具有更高清除效率的P54C突變體。透明顫菌血紅蛋白是微生物來源的類過氧化物酶,在來源方面廣泛,成本低,污水中的一些污染物也不會對其造成抑制作用。因此透明顫菌血紅蛋白作為過氧化物酶在水污染中具有很大的開發(fā)價值,可以為野生動物生境中的苯類污染物清除的新方法建立奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：生境 透明顫菌血紅蛋白 過氧化物酶 芳香族污染物
【學位授予單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：X703
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 緒論12-27
• 1.1 動物生境中污染物及其危害12-14
• 1.1.1 空氣中的污染物及危害12
• 1.1.2 土壤中的污染物及危害12-13
• 1.1.3 水環(huán)境中的污染物與影響13-14
• 1.2 水生生境污染物的清除方法14-16
• 1.2.1 物理法15
• 1.2.2 化學法15
• 1.2.3 生物法15-16
• 1.3 野生動物生境中污染物的清除——生物酶法16-19
• 1.3.1 酶16
• 1.3.2 過氧化物酶16-17
• 1.3.3 過氧化物酶特點和應(yīng)用17-19
• 1.4 透明顫菌血紅蛋白過氧化物酶19-24
• 1.4.1 透明顫菌19-20
• 1.4.2 透明顫菌血紅蛋白20-22
• 1.4.3 透明顫菌血紅蛋白的功能22-23
• 1.4.4 透明顫菌血紅蛋白的應(yīng)用23-24
• 1.5 研究目的、意義、內(nèi)容、技術(shù)路線及創(chuàng)新點24-27
• 1.5.1 研究的目的和意義24-25
• 1.5.2 研究內(nèi)容及技術(shù)路線25
• 1.5.3 課題的創(chuàng)新點25-27
• 2 透明顫菌血紅蛋白制備27-36
• 2.1 實驗材料和實驗藥品27-29
• 2.1.1 實驗材料27
• 2.1.2 實驗藥品27-28
• 2.1.3 實驗儀器28-29
• 2.2 實驗方法29-32
• 2.2.1 大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)的制備29
• 2.2.2 透明顫菌血紅蛋白質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化29-30
• 2.2.3 透明顫菌血紅蛋白的質(zhì)粒提取30
• 2.2.4 透明顫菌血紅蛋白大腸桿菌的表達30
• 2.2.5 透明顫菌血紅蛋白的純化30-32
• 2.3 實驗結(jié)果與討論32-34
• 2.3.1 透明顫菌血紅蛋白的制備32
• 2.3.2 透明顫菌血紅蛋白純度的驗證32-34
• 2.3.3 透明顫菌血紅蛋白氧化態(tài)的制備34
• 2.4 本章小結(jié)34-36
• 3 透明顫菌血紅蛋白突變體制備36-43
• 3.1 實驗材料和實驗藥品36-37
• 3.1.1 實驗材料36
• 3.1.2 實驗藥品36
• 3.1.3 實驗儀器36-37
• 3.2 實驗方法37
• 3.2.1 透明顫菌血紅蛋白突變體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化37
• 3.2.2 透明顫菌血紅蛋白突變體的質(zhì)粒提取37
• 3.2.3 透明顫菌血紅蛋白突變體的表達與純化37
• 3.2.4 透明顫菌血紅蛋白突變體氧化態(tài)的制備37
• 3.3 實驗結(jié)果37-42
• 3.3.1 透明顫菌血紅蛋白突變體純度的驗證37-40
• 3.3.2 透明顫菌血紅蛋白突變體氧化態(tài)的制備40-42
• 3.4 本章小結(jié)42-43
• 4 透明顫菌血紅蛋白及突變體對亞甲基藍的清除43-53
• 4.1 透明顫菌血紅蛋白及突變體的過氧化物酶活性43-45
• 4.1.1 透明顫菌血紅蛋白及突變體的濃度檢測43
• 4.1.2 基本酶活性的檢測43-44
• 4.1.3 亞甲基藍的清除44-45
• 4.2 結(jié)果與討論45-52
• 4.2.1 透明顫菌血紅蛋白及突變體的濃度檢測45
• 4.2.2 透明顫菌血紅蛋白及突變體的過氧化物酶活性45-46
• 4.2.3 亞甲基藍的清除46-52
• 4.3 本章小結(jié)52-53
• 5 透明顫菌血紅蛋白及突變體對生境中苯系物的清除53-67
• 5.1 苯胺的清除53-54
• 5.1.1 溫度對苯胺的清除影響53-54
• 5.1.2 不同pH對苯胺的清除影響54
• 5.1.3 苯胺的清除效率54
• 5.2 苯酚的清除54
• 5.2.1 溫度對苯酚的清除影響54
• 5.2.2 不同pH對苯酚的清除影響54
• 5.2.3 苯酚的清除效率54
• 5.3 2,4,6-三氯苯酚的清除54-55
• 5.3.1 溫度對2,4,6-三氯苯酚的清除影響54-55
• 5.3.2 不同pH對2,4,6-三氯苯酚的清除影響55
• 5.3.3 2,4,6-三氯苯酚的清除效率55
• 5.4 2,4,5-三氯苯胺的清除55
• 5.4.1 溫度對2,4,5-三氯苯胺的清除影響55
• 5.4.2 不同pH對2,4,5-三氯苯胺的清除影響55
• 5.4.3 2,4,5-三氯苯胺的清除率55
• 5.5 結(jié)果與討論55-65
• 5.5.1 苯系污染物紫外分光光度計波長的選取及生成物摩爾消光系數(shù)55-57
• 5.5.2 污染物苯胺、苯酚、2,4,5-三氯苯胺和2,4,6-三氯苯酚的清除57-65
• 5.6 本章小結(jié)65-67
• 6 展望67-68
• 結(jié)論68-69
• 參考文獻69-79
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文79-80
• 致謝80-81

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 顏世銘,李增禧,熊麗萍;微量元素醫(yī)學精要Ⅰ.微量元素的生理作用和體內(nèi)平衡[J];廣東微量元素科學;2002年09期

2 楊忠敏;;水環(huán)境中有毒污染物種類綜述[J];環(huán)境研究與監(jiān)測;2014年02期

3 孫成俊,王艷勇;對氨基酚生產(chǎn)廢水處理的研究狀況[J];化工環(huán)保;2001年05期

4 張彤,趙慶祥,黃慧,李勤,張奕;辣根過氧化物酶處理酚和氯酚的催化特性研究[J];環(huán)境科學;1998年01期

5 丁一匯;李巧萍;柳艷菊;張莉;宋亞芳;張錦;;空氣污染與氣候變化[J];氣象;2009年03期

6 劉勇弟,徐壽昌;幾種類Fenton試劑的氧化特性及在工業(yè)廢水處理中的應(yīng)用[J];上海環(huán)境科學;1994年03期

7 唐黎標;;生物技術(shù)在造紙廢水處理中的應(yīng)用[J];天津造紙;2013年04期

8 王擺;高士博;董穎;王笑月;周遵春;;6種苯系物對球等鞭金藻和新月菱形藻的生長抑制[J];生態(tài)毒理學報;2014年02期

9 于慧敏,沈忠耀;透明顫菌血紅蛋白及其基因的研究進展[J];微生物學報;1999年05期

10 賀益英;關(guān)于火、核電廠循環(huán)冷卻水的余熱利用問題[J];中國水利水電科學研究院學報;2004年04期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 傅曉文;鹽漬化石油污染土壤中重金屬的污染特征、分布和來源解析[D];山東大學;2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳劍虹;重金屬廢水處理技術(shù)的研究[D];湖南大學;2003年

2 仇麗娟;原位生物生態(tài)組合技術(shù)改善景觀水體水質(zhì)研究[D];揚州大學;2010年

  本文關(guān)鍵詞：透明顫菌血紅蛋白及其突變體蛋白對芳香族污染物清除作用的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：383054