類病毒顆粒（Virus-like particles, VLPs）是一類用于傳染性疾病預(yù)防的重要新型疫苗,有效的分離純化是確保其安全性和有效性的關(guān)鍵。色譜分離是生物大分子分離純化最主要的技術(shù),商品化的色譜填料主要是為常規(guī)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì),孔道一般小于30nm,而VLPs通常由上百個(gè)亞基組裝而成,尺寸在20～100 nm,因此其在傳統(tǒng)填料中的擴(kuò)散速率慢,甚至?xí)氯椎?導(dǎo)致分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng),以及產(chǎn)物在操作中大量失活。為此,本論文研究孔徑達(dá)到100 nm以上的新型超大孔色譜填料在乙肝表面抗原類病毒顆粒（Hepatitis B virus surface antigenVLPs, HB-VLPs）分離純化中的應(yīng)用,通過(guò)與其他類型色譜填料對(duì)比,對(duì)超大孔填料色譜分離VLPs的過(guò)程特點(diǎn)進(jìn)行了如下系統(tǒng)的研究：（1）選取具有不用孔徑的兩種瓊脂糖填料（DEAE-FF、DEAE-Capto）,四種超大孔填料（DEAE-AP-120nm、DEAE-AP-280nm、POROS D和POROSHQ）,以及一種整體柱類型的陰離子交換色譜填料,首先考察了孔徑對(duì)不同尺寸的蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)載量的影響,發(fā)現(xiàn)小孔徑的瓊脂糖填料對(duì)較小尺寸... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所)北京市

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 色譜技術(shù)在病毒和類病毒顆粒純化中的應(yīng)用
        1.1.1 色譜技術(shù)純化病毒、類病毒顆粒的難點(diǎn)
        1.1.2 色譜技術(shù)純化病毒、類病毒顆粒的解決方法
    1.2 超大孔色譜分離填料
        1.2.1 色譜分離填料發(fā)展歷程
        1.2.2 超大孔色譜分離填料的優(yōu)勢(shì)
        1.2.3 超大孔色譜分離填料的種類以及應(yīng)用
        1.2.4 超大孔填料分離純化病毒、類病毒顆粒的研究現(xiàn)狀
    1.3 蛋白質(zhì)構(gòu)象變化研究
        1.3.1 蛋白質(zhì)在色譜分離中的構(gòu)象變化的影響因素
        1.3.2 超大分子VLPs在色譜中構(gòu)象變化的研究
        1.3.3 超大孔填料提高蛋白質(zhì)在色譜中的構(gòu)象穩(wěn)定性
    1.4 蛋白質(zhì)色譜過(guò)程中構(gòu)象研究方法
        1.4.1 蛋白色譜過(guò)程中的熱力學(xué)特征
            1.4.1.1 熱力學(xué)基本原理
            1.4.1.2 蛋白質(zhì)與色譜間相互作用對(duì)熱力學(xué)參數(shù)的影響
        1.4.2 蛋白質(zhì)色譜過(guò)程中的熱力學(xué)研究方法
            1.4.2.1 Van't Hoff方程分析法
            1.4.2.2 等溫滴定量熱法
    1.5 超大孔填料分離純化疫苗的研究展望
    1.6 本文研究?jī)?nèi)容和意義
2 適合于類病毒顆粒分離純化的色譜填料篩選
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 離子交換色譜填料的表征
        2.2.2 動(dòng)態(tài)結(jié)合載量
        2.2.3 HB-VLPs的離子交換色譜
        2.2.4 酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜法分析HB-VLPs
        2.2.5 從重組漢遜酵母培養(yǎng)液中純化HB-VLPs
        2.2.6 HB-VLPs純度檢測(cè)
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        2.3.1 色譜填料的基本物性
        2.3.2 離子交換填料孔徑對(duì)不同分子量蛋白動(dòng)態(tài)載量的影響
        2.3.3 蛋白在陰離子交換填料上的分離效果
        2.3.4 流速對(duì)于HB-VLPs色譜過(guò)程中回收率和結(jié)構(gòu)的影響
        2.3.5 洗脫鹽類型對(duì)于HB-VLPs回收率和結(jié)構(gòu)的影響
        2.3.6 HB-VLPs的實(shí)際純化
    2.4 本章小結(jié)
3 填料孔徑對(duì)蛋白質(zhì)色譜性質(zhì)影響的規(guī)律研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 逆體積色譜法測(cè)定填料可及孔隙體積和表觀孔徑
        3.2.2 等度洗脫
        3.2.3 吸附平衡實(shí)驗(yàn)
        3.2.4 吸附動(dòng)力學(xué)
        3.2.5 動(dòng)態(tài)結(jié)合載量
        3.2.6 激光共聚焦
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        3.3.1 蛋白和填料的基本物性
        3.3.2 逆體積排阻色譜法對(duì)IEC填料孔徑結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征
        3.3.3 可及比表面積隨IEC填料的孔徑與蛋白大小比的變化
        3.3.4 靜態(tài)吸附載量隨著IEC填料的孔徑與蛋白大小比的變化
        3.3.5 吸附解離常數(shù)隨著IEC填料的孔徑與蛋白大小比的變化
        3.3.6 吸附動(dòng)力學(xué)隨著IEC填料的孔徑與蛋白大小比的變化
        3.3.7 動(dòng)態(tài)載量隨著IEC填料的孔徑與蛋白大小比的變化
        3.3.8 根據(jù)CLSM觀測(cè)研究蛋白質(zhì)在IEC填料上的吸附動(dòng)力學(xué)
    3.4 本章小結(jié)
4 超大孔離子交換填料提高類病毒顆粒的載量和穩(wěn)定性
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 定性離子交換填料
        4.2.2 吸附平衡實(shí)驗(yàn)
        4.2.3 動(dòng)態(tài)結(jié)合載量
        4.2.4 吸附動(dòng)力學(xué)
        4.2.5 激光共聚焦
        4.2.6 不同進(jìn)料量的HB-VLPs的離子交換色譜
        4.2.7 酶聯(lián)免疫法(ELISA)和高效液相色譜法分析HB-VLPs
        4.2.8 透射電子顯微鏡法(TEM)分析
        4.2.9 從重組漢遜酵母培養(yǎng)液中純化HB-VLPs
        4.2.10 HB-VLPs純度檢測(cè)
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 離子交換填料孔徑大小對(duì)于HB-VLPs吸附平衡的影響
            4.3.1.1 HB-VLPs在不同孔徑填料上的靜態(tài)載量
            4.3.1.2 激光共聚焦顯示孔徑大小對(duì)于HB-VLPs吸附的影響
        4.3.2 IEC填料孔徑大小對(duì)于吸附動(dòng)力學(xué)的影響
        4.3.3 IEC填料孔徑大小對(duì)于HB-VLPs動(dòng)態(tài)載量的影響
        4.3.4 IEC填料孔徑大小對(duì)于HB-VLPs色譜過(guò)程中回收率和結(jié)構(gòu)的影響
            4.3.4.1 進(jìn)料量對(duì)于HB-VLPs回收率和結(jié)構(gòu)的影響
            4.3.4.2 相同進(jìn)料量孔徑大小對(duì)于HB-VLPs回收率和結(jié)構(gòu)的影響
        4.3.5 HB-VLPs在四種填料上的實(shí)際純化
    4.4 本章小結(jié)
5 超大孔填料促進(jìn)HB-VLPs純化過(guò)程中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的熱力學(xué)機(jī)理研究
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 離子交換色譜填料的定性
        5.2.2 HB-VLPs完整顆粒在不同孔徑填料上的離子交換色譜
        5.2.3 酶聯(lián)免疫分析和高效液相色譜法分析HB-VLPs
        5.2.4 HB-VLPs完整顆粒和HB-VLPs解聚體的定性
        5.2.5 不同孔徑填料上的吸附平衡實(shí)驗(yàn)
        5.2.6 ITC實(shí)驗(yàn)：HB-VLPs完整顆粒和HB-VLPs解聚體
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        5.3.1 色譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)變化
            5.3.1.1 IEC填料的孔徑對(duì)于HB-VLPs抗原回收率的影響
            5.3.1.2 IEC填料的孔徑對(duì)于HB-VLPs結(jié)構(gòu)的影響
            5.3.1.3 圓二色譜(CD)
        5.3.2 孔徑對(duì)于HB-VLPs完整顆粒和解聚體吸附平衡的影響
        5.3.3 等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)研究
            5.3.3.1 吸附熱力學(xué)模型的建立
            5.3.3.2 HB-VLPs完整顆粒和解聚體的ITC實(shí)驗(yàn)確定模型參數(shù)
            5.3.3.3 孔徑對(duì)于HB-VLPs完整顆粒和解聚體吸附焓變的影響
            5.3.3.4 關(guān)于ITC熱力學(xué)參數(shù)的進(jìn)一步分析和討論
    5.4 本章小結(jié)
6 超大孔填料配基密度影響HB-VLPs結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的熱力學(xué)機(jī)理研究
    6.1 實(shí)驗(yàn)材料
    6.2 實(shí)驗(yàn)方法
        6.2.1 制備不同配基密度的陰離子交換填料
        6.2.2 離子交換色譜填料的性能測(cè)定
        6.2.3 HB-VLPs在不同配基密度填料上的離子交換色譜
        6.2.4 酶聯(lián)免疫分析和高效液相色譜法分析HB-VLPs
        6.2.5 HB-VLPs完整顆粒和HB-VLPs解聚體的定性
        6.2.6 不同配基密度填料上的吸附平衡實(shí)驗(yàn)
        6.2.7 ITC實(shí)驗(yàn)：HB-VLPs完整顆粒和HB-VLPs解聚體
    6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        6.3.1 色譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)變化
            6.3.1.1 IEC填料配基密度對(duì)于HB-VLPs抗原回收率的影響
            6.3.1.2 IEC填料的配基密度對(duì)于HB-VLPs結(jié)構(gòu)的影響
            6.3.1.3 圓二色譜(CD)
        6.3.2 配基密度對(duì)于HB-VLPs完整顆粒和解聚體吸附平衡的影響
        6.3.3 等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)
            6.3.3.1 熱力學(xué)模型闡明色譜過(guò)程HB-VLPs解聚體的形成
            6.3.3.2 ITC實(shí)驗(yàn)確定模型參數(shù)
            6.3.3.3 配基密度對(duì)IEC中HB-VLPs完整顆粒構(gòu)象變化焓變的影響
        6.3.4 關(guān)于ITC熱力學(xué)參數(shù)的進(jìn)一步分析和討論
        6.3.5 溶菌酶與不同配基密度填料相互作用的熱力學(xué)
    6.4 本章小結(jié)
7 結(jié)論與展望
    7.1 本文的研究結(jié)果
    7.2 本文的創(chuàng)新點(diǎn)
    7.3 展望
符號(hào)表
參考文獻(xiàn)
附錄 A圖目錄
附錄 B表目錄
個(gè)人簡(jiǎn)歷及發(fā)表文章目錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號(hào)：3272316