本文關(guān)鍵詞：葡激酶的聚乙二醇定點修飾產(chǎn)物制備及藥學(xué)性質(zhì)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修飾可有效地提高蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的循環(huán)半衰期、降低藥物對蛋白水解酶的敏感性和免疫原性。葡激酶(staphylokinase,SAK)是一種可用于治療心肌梗死的新型溶栓制劑,它的作用底物纖溶酶原是一種生物大分子。SAK的體內(nèi)循環(huán)半衰期較短,并且對人體具有較強的免疫原性,PEG修飾技術(shù)可以很好地解決葡激酶存在的這些臨床缺陷。但是,PEG分子對蛋白質(zhì)表面的空間屏蔽作用會影響蛋白質(zhì)藥物與其底物的相互作用,從而引起蛋白質(zhì)藥物的生物活性降低,這一問題在以生物大分子為作用底物的蛋白質(zhì)藥物中尤為嚴(yán)重。本研究以SAK作為模型蛋白,通過調(diào)節(jié)PEG與SAK之間的連接橋,改變PEG的構(gòu)象及其對蛋白質(zhì)的空間屏蔽效應(yīng),以期找到一種提高PEG化蛋白質(zhì)生物活性的方法。選擇遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)的活性區(qū)域進(jìn)行定點修飾是降低PEG分子對蛋白質(zhì)活性影響的有效方法。本論文中所使用的SAK為重組蛋白,在遠(yuǎn)離其活性區(qū)域的C-末端引入了半胱氨酸殘基。然后,通過3種不同的異型雙功能小分子分別將一個PEG-20K共價連接在SAK的C-末端自由巰基上。制得的3種單一定點PEG化SAK具有基本相同的結(jié)構(gòu),唯一的差別在于PEG分子與SAK之間的連接橋。這3種連接橋為苯基、丙基和戊基,其中苯基代表剛性結(jié)構(gòu),丙基和戊基代表柔性結(jié)構(gòu)(丙基和戊基可被視為不同長度的柔性結(jié)構(gòu))。圓二色光譜和熒光光譜檢測結(jié)果表明,在這3種PEG修飾產(chǎn)物中,SAK蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)均未發(fā)生明顯變化。動態(tài)光散射和分析超離心檢測結(jié)果顯示剛性連接橋介導(dǎo)形成致密的PEG構(gòu)象,PEG以緊致的結(jié)構(gòu)覆蓋于修飾位點附近；而柔性連接橋可介導(dǎo)形成疏松的PEG構(gòu)象,PEG可以舒展地覆蓋于SAK的表面。對于遠(yuǎn)離活性中心修飾的SAK,局部致密的PEG構(gòu)象對SAK的空間屏蔽效應(yīng)較小。對修飾產(chǎn)物的藥學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)局部致密的PEG構(gòu)象既能有效地提高蛋白質(zhì)的循環(huán)半衰期,降低藥物對蛋白水解酶的敏感性和免疫原性,同時能更大限度地保持蛋白質(zhì)的體外生物活性(比延展疏松的PEG構(gòu)象高15%)本研究進(jìn)一步制備了6種SAK的單PEG修飾產(chǎn)物,分別涉及到了PEG的鏈長、修飾位點和PEG與蛋白質(zhì)之間的連接橋這3種影響PEG修飾蛋白質(zhì)的因素。將修飾產(chǎn)物在70℃下加熱孵育2 h,進(jìn)一步研究了PEG的構(gòu)象及其與蛋白質(zhì)的生物活性之間的關(guān)系。圓二色光譜和熒光光譜檢測結(jié)果表明,較高的PEG分子量、遠(yuǎn)離活性區(qū)域、延展疏松的PEG構(gòu)象在保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面更具優(yōu)勢。分析超離心研究結(jié)果顯示加熱作用使得PEG構(gòu)象由延展疏松變?yōu)榫植恐旅�。這種構(gòu)象轉(zhuǎn)變使得通過戊基連接橋介導(dǎo)的PEG-20K修飾SAK產(chǎn)物中的PEG活性區(qū)域的屏蔽效應(yīng)變小,相對生物活性升高(～27%)。這個結(jié)果進(jìn)一步說明了局部致密的PEG構(gòu)象可降低PEG對蛋白質(zhì)藥物的空間屏蔽效應(yīng),提高PEG化蛋白質(zhì)藥物的生物活性。本研究的修飾策略可對其它以生物大分子為作用底物的蛋白質(zhì)藥物的PEG修飾方法提供借鑒。
【關(guān)鍵詞】：PEG修飾 葡激酶 空間屏蔽效應(yīng) 生物活性 加熱處理
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(過程工程研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TQ460.1
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 1 文獻(xiàn)綜述14-56
• 1.1 蛋白質(zhì)藥物簡介14-15
• 1.2 蛋白質(zhì)藥物的聚乙二醇修飾15-19
• 1.2.1 聚乙二醇及聚乙二醇化蛋白質(zhì)藥物的性質(zhì)15-17
• 1.2.2 聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)藥物的研究進(jìn)展17-19
• 1.3 蛋白質(zhì)藥物的聚乙二醇修飾策略19-33
• 1.3.1 聚乙二醇分子量的選擇20-21
• 1.3.2 聚乙二醇形狀的選擇21-22
• 1.3.3 聚乙二醇修飾位點的選擇22-30
• 1.3.3.1 隨機修飾22-25
• 1.3.3.2 末端-NH_2修飾25-26
• 1.3.3.3 巰基定點修飾26-28
• 1.3.3.4 二硫鍵定點修飾28-29
• 1.3.3.5 酶催化介導(dǎo)的定點修飾29-30
• 1.3.4 特殊PEG修飾策略30-32
• 1.3.4.1 活性位點的保護(hù)30-31
• 1.3.4.2 可逆PEG修飾31
• 1.3.4.3 非共價PEG修飾31-32
• 1.3.5 固相修飾32-33
• 1.4 聚乙二醇化蛋白質(zhì)藥物的分離純化33-37
• 1.4.1 按分子體積的不同進(jìn)行分離33-35
• 1.4.1.1 凝膠過濾層析33-34
• 1.4.1.2 超濾34-35
• 1.4.2 按靜電作用力的不同進(jìn)行分離35-36
• 1.4.3 按疏水性的不同進(jìn)行分離36-37
• 1.5 聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)藥物的表征和結(jié)構(gòu)分析37-45
• 1.5.1 電泳法37-38
• 1.5.2 凝膠過濾高效液相色譜法38-39
• 1.5.3 反相高效液相色譜法39-40
• 1.5.4 質(zhì)譜40
• 1.5.5 圓二色光譜40-41
• 1.5.6 熒光光譜41-42
• 1.5.7 動態(tài)光散射42-43
• 1.5.8 分析超離心43-44
• 1.5.9 紅外光譜44
• 1.5.10 核磁共振技術(shù)44-45
• 1.6 聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的藥學(xué)性質(zhì)分析45-47
• 1.6.1 表面等離子共振45-46
• 1.6.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗46-47
• 1.7 模型蛋白葡激酶的研究進(jìn)展47-53
• 1.7.1 葡激酶的結(jié)構(gòu)47-48
• 1.7.2 葡激酶的溶栓機理48-50
• 1.7.3 葡激酶的臨床應(yīng)用和免疫原性50-51
• 1.7.4 葡激酶改造研究進(jìn)展51-53
• 1.7.4.1 定點突變51-52
• 1.7.4.2 融合蛋白52
• 1.7.4.3 聚乙二醇修飾52-53
• 1.8 論文的立題思想53-56
• 2 基于連接橋的葡激酶C-末端定點修飾產(chǎn)物制備及鑒定56-80
• 2.1 引言56-58
• 2.2 實驗材料與設(shè)備58-59
• 2.3 實驗方法59-65
• 2.3.1 重組葡激酶的表達(dá)與純化59-60
• 2.3.2 葡激酶的PEG定點修飾產(chǎn)物的制備與純化60-61
• 2.3.2.1 修飾劑衍生物的合成60
• 2.3.2.2 葡激酶修飾產(chǎn)物的制備60-61
• 2.3.2.3 葡激酶修飾產(chǎn)物的純化61
• 2.3.3 檢測方法61-65
• 2.3.3.1 蛋白質(zhì)濃度測定61-62
• 2.3.3.2 還原性SDS-PAGE62-64
• 2.3.3.3 凝膠過濾高效液相色譜分析64
• 2.3.3.4 反相高效液相色譜分析64
• 2.3.3.5 傅里葉變換紅外光譜64-65
• 2.3.3.6 核磁共振光譜65
• 2.3.3.7 質(zhì)譜65
• 2.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析65
• 2.4 實驗結(jié)果與討論65-78
• 2.4.1 重組葡激酶的表達(dá)與純化65-67
• 2.4.2 葡激酶的PEG定點修飾67-72
• 2.4.2.1 修飾劑衍生物的合成67-69
• 2.4.2.2 葡激酶修飾產(chǎn)物的制備69-70
• 2.4.2.3 葡激酶修飾產(chǎn)物的純化70-72
• 2.4.3 葡激酶修飾產(chǎn)物的鑒定72-78
• 2.4.3.1 還原性SDS-PAGE72-73
• 2.4.3.2 質(zhì)譜73-75
• 2.4.3.3 凝膠過濾高效液相色譜75-76
• 2.4.3.4 反相高效液相色譜76-78
• 2.5 本章小結(jié)78-80
• 3 基于連接橋的葡激酶定點修飾產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及藥學(xué)性質(zhì)研究80-120
• 3.1 引言80
• 3.2 實驗材料與設(shè)備80-81
• 3.3 實驗方法81-90
• 3.3.1 體外生物活性81-82
• 3.3.2 表面等離子共振82
• 3.3.3 圓二色光譜82-83
• 3.3.4 熒光光譜83-84
• 3.3.4.1 內(nèi)源熒光光譜83
• 3.3.4.2 外源熒光光譜83
• 3.3.4.3 熒光淬滅83-84
• 3.3.5 動態(tài)光散射84
• 3.3.6 分析超離心84
• 3.3.7 蛋白水解酶敏感性84
• 3.3.8 免疫原性84-86
• 3.3.8.1 動物免疫85
• 3.3.8.2 血清中抗-SAK的IgG滴度測定85-86
• 3.3.9 藥代動力學(xué)性質(zhì)86-89
• 3.3.9.1 動物實驗方案87
• 3.3.9.2 抗SAK多克隆抗體的純化87-88
• 3.3.9.3 酶標(biāo)抗體的制備88
• 3.3.9.4 血藥濃度測定88-89
• 3.3.10 分子動力學(xué)模擬89-90
• 3.4 實驗結(jié)果與討論90-117
• 3.4.1 體外生物活性90-92
• 3.4.2 表面等離子共振92-95
• 3.4.3 圓二色光譜95-97
• 3.4.4 熒光光譜97-102
• 3.4.4.1 內(nèi)源熒光光譜97-98
• 3.4.4.2 外源熒光光譜98-99
• 3.4.4.3 熒光淬滅99-102
• 3.4.5 動態(tài)光散射102-104
• 3.4.6 分析超離心104-106
• 3.4.7 蛋白水解酶敏感性106-109
• 3.4.8 免疫原性109-110
• 3.4.9 藥代動力學(xué)性質(zhì)110-115
• 3.4.9.1 抗SAK多克隆抗體的純化110-112
• 3.4.9.2 酶標(biāo)抗體的制備112-113
• 3.4.9.3 血藥濃度測定113-115
• 3.4.10 分子動力學(xué)模擬115-117
• 3.5 本章小結(jié)117-120
• 4 加熱對PEG化SAK結(jié)構(gòu)及活性的影響120-140
• 4.1 引言120-121
• 4.2 實驗材料和儀器121
• 4.3 實驗方法121-123
• 4.3.1 葡激酶的修飾產(chǎn)物的制備和純化121-122
• 4.3.1.1 葡激酶的N-末端單一定點修飾產(chǎn)物的制備和純化121-122
• 4.3.1.2 葡激酶的C-末端單一定點修飾產(chǎn)物的制備和純化122
• 4.3.2 加熱處理122-123
• 4.3.3 還原性SDS-PAGE123
• 4.3.4 凝膠過濾高效液相色譜123
• 4.3.5 圓二色光譜123
• 4.3.6 內(nèi)源熒光廣譜123
• 4.3.7 分析超離心123
• 4.3.8 溶劑可及化表面積123
• 4.4 實驗結(jié)果及討論123-137
• 4.4.1 葡激酶修飾產(chǎn)物的分析鑒定123-125
• 4.4.2 葡激酶修飾產(chǎn)物經(jīng)加熱處理后的生物活性分析125-128
• 4.4.3 圓二色光譜法128-130
• 4.4.4 內(nèi)源熒光光譜法130-132
• 4.4.5 凝膠過濾高效液相色譜132-133
• 4.4.6 分析超離心133-135
• 4.4.7 溶劑可及化表面積135-137
• 4.5 本章小結(jié)137-140
• 5 結(jié)論與展望140-144
• 5.1 本論文的研究結(jié)果140-141
• 5.2 本論文的創(chuàng)新點141-142
• 5.3 今后的研究方向142-144
• 符號表144-146
• 參考文獻(xiàn)146-160
• 附錄A 圖目錄160-162
• 附錄B 表目錄162-164
• 附錄C 方程目錄164-166
• 個人簡歷及發(fā)表文章目錄166-168
• 致謝168

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本文編號：293944