本文關(guān)鍵詞：大豆致敏蛋白glycinin和β-conglycinin免疫學快速檢測技術(shù)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：食物過敏是一種重要的過敏病癥,是機體暴露于某種食物或食物成分時由特定免疫應(yīng)答引起的可重復(fù)發(fā)生的不良反應(yīng)。食物過敏能夠?qū)е虏煌潭鹊臋C體損傷,包括消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和皮膚的損傷,甚至可以導(dǎo)致致命的過敏性休克。因此,食物過敏被視為影響公眾營養(yǎng)衛(wèi)生的食品安全問題之一。隨著人們對食物過敏問題的日益重視,針對食物過敏原的快速、準確的檢測方法得到了發(fā)展,其中免疫學方法具有靈敏性高、特異性強的特點,能夠進行定性、定量檢測而成為研究熱點。作為一種重要的糧食作物,大豆應(yīng)用廣泛,并在人類和動物營養(yǎng)方面起著至關(guān)重要的作用,但大豆也是八種主要致敏性食物之一,含有多種致敏蛋白,容易引發(fā)嬰幼兒及幼齡動物出現(xiàn)過敏反應(yīng)。本研究以大豆中的兩種主要致敏蛋白glycinin和β-conglycinin為研究對象,在制備免疫學特性良好的兔源多克隆抗體(Polyclonal antibody,p Ab)和鼠源單克隆抗體(Monoclonal antibody,m Ab)的基礎(chǔ)之上,研制出分別用于glycinin和β-conglycinin快速檢測的雙抗體夾心ELISA試劑盒和膠體金免疫層析試紙。一方面可以應(yīng)用于食品標簽上大豆致敏成分標注信息的快速準確監(jiān)管,進一步提高大豆過敏消費者的食品安全;另一方面可以作為研究大豆致敏蛋白脫敏方法的有效工具,用于鑒定脫敏方法的可行性與有效性。本研究的主要研究結(jié)果如下:(1)利用等電點沉淀法從脫脂大豆粉中分離純化glycinin和β-conglycinin,將glycinin和β-conglycinin分別免疫新西蘭大白兔,采用頸部皮下多點注射,四次免疫之后進行心臟采血并分離血清。利用飽和硫酸銨沉淀法純化制備glycinin兔源p Ab和β-conglycinin兔源p Ab,經(jīng)ELISA方法鑒定,效價分別為1:1.024×106和1:5.12×105,并且具有良好的敏感性和較強的特異性。(2)將glycinin和β-conglycinin分別免疫6~8周齡的BALB/c小鼠,選擇多克隆抗血清效價高、敏感性好的小鼠,應(yīng)用細胞融合技術(shù)建立雜交瘤細胞系,經(jīng)過對陽性雜交瘤的篩選,獲得1株穩(wěn)定分泌glycinin m Ab的雜交瘤細胞株2C3和3株穩(wěn)定分泌β-conglycinin m Ab的雜交瘤細胞株1G6、7E7、8C11。通過小鼠體內(nèi)誘生腹水法制備m Ab,這4株m Ab的亞型均為Ig G1型,間接ELISA測定效價分別為1:5.12×105、1:2.56×105、1:1.024×106和1:5.12×105;間接競爭ELISA測定半數(shù)抑制濃度分別為498.7 ng/m L,844.2 ng/m L、479.4 ng/m L和889.6 ng/m L;ELISA飽和法測定親和常數(shù)分別為4.27×109 L/mol、3.29×108 L/mol、1.34×109 L/mol和3.48×108 L/mol。交叉反應(yīng)試驗和免疫印跡試驗表明4株m Ab均具有很強的特異性。(3)基于制備的兔源p Ab和鼠源m Ab,利用雙抗體夾心模式建立glycinin和β-conglycinin的ELISA檢測方法。應(yīng)用2C3 m Ab和glycinin兔源p Ab研制出glycinin雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒,檢測限為16.3 ng/m L,線性檢測范圍為15.625~2000 ng/m L,奶粉樣品的平均添加回收率為80.5%~88.9%,變異系數(shù)小于15%;應(yīng)用7E7 m Ab和β-conglycinin兔源p Ab研制出β-conglycinin雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒,檢測限為15.4 ng/m L,線性檢測范圍為15.625~2000 ng/m L,奶粉樣品的平均添加回收率為83.4%~90.9%,變異系數(shù)小于15%。兩種試劑盒與其他常見食物致敏蛋白無交叉反應(yīng),特異性良好,且具有很好的穩(wěn)定性,能夠在4℃條件下避光保存至少3個月。(4)基于膠體金免疫層析技術(shù),利用制備的兔源p Ab和鼠源m Ab,首次成功研制出分別用于glycinin和β-conglycinin快速檢測的膠體金免疫層析試紙。Glycinin試紙的目測和機讀檢測限分別為100 ng/m L和46.1 ng/m L;β-conglycinin試紙的目測和機讀檢測限分別為200 ng/m L和152.8 ng/m L。兩種試紙的奶粉樣品平均添加回收率和變異系數(shù)均在正常范圍內(nèi),與其他常見食物致敏蛋白無交叉反應(yīng),特異性強,且重復(fù)性和穩(wěn)定性良好,可以常溫密封干燥保存至少3個月。
【關(guān)鍵詞】：大豆致敏蛋白 多克隆抗體 單克隆抗體 雙抗體夾心ELISA 膠體金免疫層析試紙
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TS207.3
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-17
• 第一章 文獻綜述17-34
• 1.1 食物過敏概述17-24
• 1.1.1 超敏反應(yīng)的分類及特點17-18
• 1.1.2 食物過敏反應(yīng)及其機制18-19
• 1.1.3 食物過敏原19-21
• 1.1.3.1 主要的動物性食物過敏原20
• 1.1.3.2 主要的植物性食物過敏原20-21
• 1.1.3.3 轉(zhuǎn)基因食品以及食品添加劑21
• 1.1.4 國內(nèi)外食物過敏現(xiàn)狀21-22
• 1.1.5 國內(nèi)外食物過敏安全管理及致敏標識現(xiàn)狀22-24
• 1.2 大豆致敏蛋白的種類及危害24-27
• 1.2.1 Glycinin25-26
• 1.2.2 β-conglycinin26
• 1.2.3 大豆致敏蛋白的危害26-27
• 1.3 大豆致敏蛋白檢測技術(shù)研究進展27-31
• 1.3.1 色譜和質(zhì)譜分析法28
• 1.3.2 聚合酶鏈式反應(yīng)法28-29
• 1.3.3 免疫印跡試驗29
• 1.3.4 放射或酶聯(lián)過敏原吸附抑制試驗29-30
• 1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗30-31
• 1.4 本研究的目的及意義31-32
• 1.5 本研究的主要內(nèi)容和技術(shù)路線32-34
• 1.5.1 本研究的主要內(nèi)容32-33
• 1.5.2 本研究的技術(shù)路線33-34
• 第二章 Glycinin和 β-conglycinin兔源多克隆抗體的制備及其免疫學特性鑒定34-46
• 2.1 材料和儀器34-36
• 2.1.1 試劑34-35
• 2.1.2 溶液35-36
• 2.1.3 實驗動物36
• 2.1.4 儀器設(shè)備36
• 2.2 方法36-40
• 2.2.1 等電點沉淀法分離glycinin和 β-conglycinin36-37
• 2.2.2 Glycinin和 β-conglycinin的純度分析37
• 2.2.3 Glycinin和 β-conglycinin兔源p Ab的制備37-38
• 2.2.3.1 動物免疫程序37-38
• 2.2.3.2 動物采血方法38
• 2.2.3.3 兔源p Ab的純化38
• 2.2.4 Glycinin和 β-conglycinin兔源p Ab的免疫學特性鑒定38-40
• 2.2.4.1 間接ELISA測定兔源p Ab效價39
• 2.2.4.2 間接競爭ELISA鑒定兔源p Ab敏感性39
• 2.2.4.3 兔源p Ab特異性鑒定39-40
• 2.3 結(jié)果與分析40-43
• 2.3.1 Glycinin和 β-conglycinin的分離與純度分析40
• 2.3.2 Glycinin和 β-conglycinin兔源p Ab效價40-41
• 2.3.3 Glycinin和 β-conglycinin兔源p Ab敏感性41-42
• 2.3.4 Glycinin和 β-conglycinin兔源p Ab特異性42-43
• 2.4 討論43-45
• 2.4.1 關(guān)于glycinin和 β-conglycinin分離與鑒定43-44
• 2.4.2 關(guān)于免疫原的制備以及免疫方式的選擇44
• 2.4.3 關(guān)于glycinin和 β-conglycinin兔源p Ab的免疫學特性鑒定44-45
• 2.5 小結(jié)45-46
• 第三章 Glycinin和 β-conglycinin鼠源單克隆抗體的制備及其免疫學特性鑒定46-69
• 3.1 材料和儀器46-48
• 3.1.1 試劑46-47
• 3.1.2 溶液47-48
• 3.1.3 實驗動物與骨髓瘤細胞48
• 3.1.4 儀器設(shè)備48
• 3.2 方法48-54
• 3.2.1 Glycinin和 β-conglycinin鼠源多克隆抗血清的制備48-49
• 3.2.2 Glycinin和 β-conglycinin鼠源多克隆抗血清的免疫學特性鑒定49
• 3.2.2.1 多克隆抗血清的效價測定49
• 3.2.2.2 多克隆抗血清的敏感性鑒定49
• 3.2.3 Glycinin和 β-conglycinin鼠源m Ab雜交瘤細胞株的建立49-52
• 3.2.3.1 細胞融合所用小鼠的選擇與超免49-50
• 3.2.3.2 小鼠NS0骨髓瘤細胞的培養(yǎng)50
• 3.2.3.3 小鼠脾細胞的分離50
• 3.2.3.4 細胞融合過程及細胞培養(yǎng)50-51
• 3.2.3.5 飼養(yǎng)細胞（腹腔巨噬細胞）的制備51
• 3.2.3.6 雜交瘤細胞陽性孔的篩選和克隆51-52
• 3.2.4 Glycinin和 β-conglycinin鼠源m Ab的大量制備52
• 3.2.5 Glycinin和 β-conglycinin鼠源m Ab的免疫學特性鑒定52-54
• 3.2.5.1 亞型鑒定52-53
• 3.2.5.2 效價測定53
• 3.2.5.3 敏感性鑒定53
• 3.2.5.4 親和常數(shù)測定53
• 3.2.5.5 特異性鑒定53-54
• 3.3 結(jié)果與分析54-65
• 3.3.1 Glycinin和 β-conglycinin鼠源多抗血清效價測定54-55
• 3.3.2 Glycinin和 β-conglycinin鼠源多克隆抗血清敏感性鑒定55-56
• 3.3.3 Glycinin和 β-conglycinin鼠源m Ab雜交瘤細胞株的建立56-58
• 3.3.4 Glycinin鼠源m Ab的免疫學特性鑒定58-61
• 3.3.4.1 Glycinin鼠源m Ab亞型58-59
• 3.3.4.2 Glycinin鼠源m Ab效價59
• 3.3.4.3 Glycinin鼠源m Ab敏感性59-60
• 3.3.4.4 Glycinin鼠源m Ab親和常數(shù)60
• 3.3.4.5 Glycinin鼠源m Ab特異性60-61
• 3.3.5 β-conglycinin鼠源m Ab的免疫學特性鑒定61-65
• 3.3.5.1 β-conglycinin鼠源m Ab的亞型61-62
• 3.3.5.2 β-conglycinin鼠源m Ab效價62
• 3.3.5.3 β-conglycinin鼠源m Ab敏感性62-63
• 3.3.5.4 β-conglycinin鼠源m Ab親和常數(shù)63-64
• 3.3.5.5 β-conglycinin鼠源m Ab特異性64-65
• 3.4 討論65-68
• 3.4.1 關(guān)于BALB/c小鼠的免疫及融合前超免65-66
• 3.4.2 關(guān)于細胞融合過程及陽性雜交瘤細胞篩選66-67
• 3.4.3 關(guān)于glycinin和 β-conglycinin鼠源m Ab的大量制備67
• 3.4.4 關(guān)于glycinin和 β-conglycinin鼠源m Ab的免疫學特性鑒定67-68
• 3.5 小結(jié)68-69
• 第四章 雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的研制及其特性鑒定69-83
• 4.1 材料和儀器69-70
• 4.1.1 試劑69
• 4.1.2 溶液69-70
• 4.1.3 儀器設(shè)備70
• 4.2 方法70-72
• 4.2.1 Glycinin和 β-conglycinin雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立70-71
• 4.2.1.1 雙抗體夾心ELISA檢測方法基本操作步驟70
• 4.2.1.2 捕獲抗體包被濃度以及檢測抗體工作濃度的優(yōu)化70-71
• 4.2.1.3 樣品與捕獲抗體反應(yīng)時間的優(yōu)化71
• 4.2.2 雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的裝配71
• 4.2.3 雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒標準曲線的繪制與結(jié)果判定71
• 4.2.4 雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的特性鑒定71-72
• 4.2.4.1 檢測限鑒定71-72
• 4.2.4.2 準確度和精密度鑒定72
• 4.2.4.3 特異性鑒定72
• 4.2.4.4 穩(wěn)定性鑒定72
• 4.3 結(jié)果與分析72-78
• 4.3.1 雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立72-74
• 4.3.1.1 捕獲抗體包被濃度以及檢測抗體工作濃度的確定72-73
• 4.3.1.2 樣品與捕獲抗體的反應(yīng)時間73-74
• 4.3.2 雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的檢測流程74-75
• 4.3.3 雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的標準曲線75
• 4.3.4 雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的特性鑒定結(jié)果75-78
• 4.3.4.1 檢測限75-76
• 4.3.4.2 準確度和精密度76-77
• 4.3.4.3 特異性77-78
• 4.3.4.4 穩(wěn)定性78
• 4.4 討論78-81
• 4.4.1 關(guān)于ELISA檢測試劑盒的模式選擇78-79
• 4.4.2 關(guān)于捕獲抗體和檢測抗體的選擇和優(yōu)化79-80
• 4.4.3 關(guān)于試劑盒的顯色系統(tǒng)80-81
• 4.4.4 關(guān)于試劑盒的特性鑒定81
• 4.5 小結(jié)81-83
• 第五章 膠體金免疫層析快速檢測試紙的研制及其特性鑒定83-103
• 5.1 材料和儀器83-85
• 5.1.1 試劑材料83-84
• 5.1.2 溶液84
• 5.1.3 儀器設(shè)備84-85
• 5.2 方法85-90
• 5.2.1 膠體金納米顆粒的制備85
• 5.2.2 膠體金納米顆粒的特性鑒定85-86
• 5.2.2.1 裸眼觀察85
• 5.2.2.2 分光光度法85
• 5.2.2.3 透射電鏡掃描法85-86
• 5.2.3 膠體金標記m Ab的制備86
• 5.2.3.1 待標記m Ab的前處理86
• 5.2.3.2 待標記m Ab最佳標記量的確定86
• 5.2.3.3 膠體金標記m Ab86
• 5.2.4 結(jié)合墊的制備86-87
• 5.2.5 樣品墊與吸水墊的制備87
• 5.2.6 NC膜的制備87
• 5.2.7 膠體金免疫層析試紙的裝配87-88
• 5.2.8 膠體金免疫層析試紙的檢測原理88
• 5.2.9 膠體金免疫層析試紙檢測方法的建立88-89
• 5.2.9.1 目測半定量檢測方法88-89
• 5.2.9.2 讀條儀機讀定量檢測方法89
• 5.2.10膠體金免疫層析試紙的性能鑒定89-90
• 5.2.10.1 檢測限鑒定89
• 5.2.10.2 準確度鑒定89-90
• 5.2.10.3 特異性鑒定90
• 5.2.10.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性鑒定90
• 5.3 結(jié)果與分析90-98
• 5.3.1 膠體金納米顆粒的特性90-91
• 5.3.2 待標記m Ab的最佳標記量91-92
• 5.3.3 膠體金免疫層析試紙性能鑒定結(jié)果92-98
• 5.3.3.1 目測半定量檢測限92-93
• 5.3.3.2 機讀定量檢測限93-96
• 5.3.3.3 準確度96-97
• 5.3.3.4 特異性97
• 5.3.3.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性97-98
• 5.4 討論98-102
• 5.4.1 關(guān)于制備膠體金納米顆粒的注意事項98-99
• 5.4.2 關(guān)于膠體金納米顆粒的粒徑大小99-100
• 5.4.3 關(guān)于膠體金納米顆粒標記m Ab的制備100
• 5.4.4 關(guān)于NC膜的選擇100-101
• 5.4.5 關(guān)于試紙檢測原理及其檢測模式選擇101
• 5.4.6 關(guān)于試紙的特性鑒定101-102
• 5.5 小結(jié)102-103
• 第六章 結(jié)論、創(chuàng)新點及展望103-105
• 6.1 研究結(jié)論103
• 6.2 創(chuàng)新點103-104
• 6.3 展望104-105
• 參考文獻105-114
• 縮略詞114-117
• 致謝117-119
• 作者簡介119-120

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本文編號：287778