發(fā)布時(shí)間：2020-07-12 18:53

【摘要】：肽的抗氧化活性被得到廣泛認(rèn)可,且具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高及吸收快等優(yōu)點(diǎn)。因此,抗氧化肽在開(kāi)發(fā)延緩衰老的保健食品中具有極大的應(yīng)用前景。然而,目前對(duì)于食源性抗氧化肽的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室階段,對(duì)于抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系及定向制備等方面的研究還不夠深入和系統(tǒng),因而較難進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化推廣。本論文對(duì)氨基酸及二肽的體外抗氧化活性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,探討了影響二肽體外抗氧化活性的關(guān)鍵性因素,并研究了抗氧化二肽的定量構(gòu)效關(guān)系,旨在為后續(xù)抗氧化肽蛋白原料的定向篩選及目標(biāo)抗氧化肽的高效制備提供理論指導(dǎo)。本論文的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)探討了DPPH及ABTS法評(píng)價(jià)氨基酸及肽類物質(zhì)抗氧化活性時(shí)存在的問(wèn)題并對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。結(jié)果表明,在DPPH法中,堿性氨基酸Arg會(huì)使DPPH?還原后的產(chǎn)物DPPHH發(fā)生去質(zhì)子化反應(yīng),導(dǎo)致在檢測(cè)波長(zhǎng)515-525 nm處有很強(qiáng)的吸收強(qiáng)度,從而對(duì)該方法的檢測(cè)產(chǎn)生干擾;采用醋酸鹽緩沖溶液,并控制這個(gè)反應(yīng)體系的最終pH值維持在弱酸環(huán)境中,可以避免上述干擾。在ABTS法中,不同的氨基酸及二肽清除ABTS?+的能力受pH影響不同,其中Tyr、Trp及其相關(guān)的二肽清除ABTS?+的反應(yīng)速率隨著pH值的升高而加快,而Cys及其相關(guān)的二肽則受pH影響較小;在pH 7.4下,所有檢測(cè)的氨基酸及二肽清除ABTS?+在常用的6-10 min的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)均不能達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn),至少需要反應(yīng)30 min才能基本達(dá)到平衡。(2)研究了20種氨基酸及40種二肽在ABTS、ORAC、DPPH、還原力及Fe2+離子螯合能力等方法中的抗氧化活性,探討了抗氧化氨基酸對(duì)二肽體外抗氧化活性的影響,并進(jìn)一步通過(guò)測(cè)定9種多肽的抗氧化活性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明,在ABTS及ORAC法中,Tyr、Trp及含有Tyr/Trp殘基的二肽均具有非常強(qiáng)的自由基清除活性(Trolox當(dāng)量為0.74-5.90μmol TE/μmol),其次為Cys、Met及含有Cys/Met殘基的二肽(Trolox當(dāng)量為0.14-2.00μmol TE/μmol),而其余不含Tyr、Trp、Cys或Met的二肽則基本無(wú)活性;在DPPH及還原力法中,只有Cys及含Cys殘基的二肽具有明顯的抗氧化活性(Trolox當(dāng)量為0.12-0.85μmol TE/μmol);在Fe2+螯合能力方面,這些氨基酸及二肽均沒(méi)有檢測(cè)到活性。這說(shuō)明了Tyr、Trp、Cys及Met等4種抗氧化氨基酸是決定二肽抗氧化活性的關(guān)鍵性因素。經(jīng)測(cè)定9種多肽的體外抗氧化活性也驗(yàn)證了這個(gè)規(guī)律。(3)研究了不同類型的二肽在AAPH誘導(dǎo)的血紅細(xì)胞氧化損傷模型中溶血的保護(hù)作用,探討了抗氧化氨基酸對(duì)二肽在血紅細(xì)胞氧化損傷模型中保護(hù)作用的影響,并進(jìn)一步以Tyr-Gly、Trp-Gly、Cys-Gly及Met-Gly為研究對(duì)象,探討了其保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果表明所有含Tyr、Trp、Cys及Met殘基的二肽對(duì)AAPH誘導(dǎo)的血紅細(xì)胞溶血均具有一定的保護(hù)作用,其中含Trp殘基的二肽保護(hù)作用最強(qiáng),而其余不含這四種抗氧化氨基酸殘基的二肽則基本無(wú)保護(hù)作用。此外,Tyr-Gly、Trp-Gly、Cys-Gly及Met-Gly等二肽在該模型中對(duì)血紅細(xì)胞溶血的保護(hù)作用均具有時(shí)間及濃度依賴關(guān)系,并能降低血紅細(xì)胞中血紅蛋白的氧化程度以及延緩血紅細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)的消耗。這些二肽主要是通過(guò)清除ROO?,阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),從而達(dá)到保護(hù)作用。(4)進(jìn)一步研究了48種N端或C端含有Tyr/Trp殘基二肽的體外抗氧化活性,并通過(guò)氨基酸描述符及密度泛函理論對(duì)其進(jìn)行定量構(gòu)效關(guān)系研究。結(jié)果表明,大部分二肽其序列中Tyr/Trp殘基在N端比其在C端具有更強(qiáng)的ABTS?+及ROO?清除能力,且其鄰位氨基酸殘基對(duì)二肽的抗氧化活性也有一定的影響;DPPS模型表明含Tyr殘基的二肽其序列中C端氨基酸殘基的空間立體大小、疏水性、氫鍵形成能力及電性與其ABTS?+清除能力呈負(fù)相關(guān),而其N端氨基酸殘基的疏水性及氫鍵形成能力與其活性呈正相關(guān);密度泛函理論研究表明二肽序列中Tyr及Trp殘基側(cè)鏈基團(tuán)的前線分子軌道的電子云分布情況及其BDE、IP、PA和ETE值基本不受其鄰位氨基酸殘基的影響,可能是受場(chǎng)效應(yīng)、空間效應(yīng)及氫鍵作用等因素的影響。(5)基于抗氧化肽的氨基酸組成特點(diǎn),定向的篩選了適合于制備抗氧化肽的蛋白原料,并通過(guò)Sephadex G-25及UPLC-ESI-UHR-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)目標(biāo)抗氧化肽進(jìn)行分離鑒定。結(jié)果表明,大米蛋白、酪蛋白、花生分離蛋白、大豆分離蛋白、小麥面筋蛋白及明膠等蛋白原料的酶解產(chǎn)物在ABTS及ORAC法中的抗氧化活性與其蛋白原料中的Tyr、Trp、Cys及Met等抗氧化氨基酸的含量高度相關(guān)(尤其是Tyr及Trp),其中富含Tyr和Trp的大米蛋白及酪蛋白的酶解產(chǎn)物抗氧化活性最強(qiáng),而缺乏Tyr、Trp、Cys及Met等抗氧化氨基酸的明膠其酶解產(chǎn)物抗氧化活性最弱。以大米蛋白為原料對(duì)其進(jìn)行酶解及分離鑒定,最后在大米蛋白復(fù)合蛋白酶(Protease M)水解產(chǎn)物中共鑒定出27條含有Tyr或Trp等抗氧化氨基酸殘基的肽段,并通過(guò)合成驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)這些肽段均具有較強(qiáng)的抗氧化活性,其中YR、WN、YY、AW、WV、YW、IW、YNPR、TYNPR、GYPR、NWR、WQSS、WQS、IGYPR、LGYPR、LQPY、TNPW、MYPIPR、MYPLPR及VNPW等20條肽段的抗氧化活性強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑Trolox。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TS201.2

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本文編號(hào)：2752356