本文關(guān)鍵詞：基于兩性離子載體材料的小干擾RNA藥物輸遞體系的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)藥物在疾病治療中具有廣泛的應(yīng)用前景,但是,siRNA藥物的自身缺點是其臨床應(yīng)用的最大挑戰(zhàn)。目前,常采用PEG修飾的陽離子脂質(zhì)體進(jìn)行siRNA藥物的遞送治療,以克服siRNA藥物治療中的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)障礙。然而,PEG修飾嚴(yán)重影響陽離子脂質(zhì)體對siRNA藥物的包埋,降低了陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物(Lipoplexes)的細(xì)胞內(nèi)吞及內(nèi)涵體逃逸能力。同時,PEG修飾會引發(fā)“加快血液清除”(Accelerated blood clearance, ABC)的免疫反應(yīng),嚴(yán)重影響siRNA藥物在靶部位的富集和治療效果。針對以上難題,本文設(shè)計了基于兩性離子聚合物聚羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯(Poly(carboxybetaine), PCB)的陽離子脂質(zhì)體siRNA藥物輸遞體系,通過體外和體內(nèi)實驗證明所構(gòu)建的PCB修飾陽離子脂質(zhì)體siRNA藥物輸遞體系可以有效地遞送siRNA藥物至靶細(xì)胞,顯著提高了siRNA藥物的作用效果。論文具體開展的研究工作如下：(1)設(shè)計合成了PCB修飾的脂質(zhì)分子二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-poly(carboxybetaine)n, DSPE-PCBn),用于構(gòu)建新型長循環(huán)陽離子脂質(zhì)體。其中,DSPE-PCB20在生理條件下可以有效增強(qiáng)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的血清穩(wěn)定性,效果與DSPE-PEG 2000相當(dāng)。同時,由于PCB獨特的結(jié)構(gòu),即PCB分子中含有大量的負(fù)電荷羧酸根基團(tuán),其在內(nèi)涵體的酸性條件下可以質(zhì)子化,增加了陽離子脂質(zhì)體表面的正電荷,促進(jìn)陽離子脂質(zhì)體對負(fù)電荷內(nèi)涵體膜的擾動,從而有利于siRNA藥物逃離內(nèi)涵體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮基因沉默作用。DSPE-PCB20陽離子脂質(zhì)體因具有顯著的血清穩(wěn)定性、siRNA藥物復(fù)合能力和內(nèi)涵體逃逸能力,其負(fù)載針對肝部載脂蛋白B (Apolipoprotein B, ApoB)的siRNA藥物可以有效下調(diào)ApoB的表達(dá),從而從根源上降低了血液中膽固醇的含量,在治療高膽固醇血癥方面具有很好的應(yīng)用前景。(2)制備了DSPE-PCB20修飾的新型長循環(huán)陽離子脂質(zhì)體,考察尾靜脈注射DSPE-PCB20修飾陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物是否可以避免ABC現(xiàn)象。與DSPE-PEG2000修飾的陽離子脂質(zhì)體／siRNA復(fù)合物不同,DSPE-PCB20陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物可以有效避免ABC現(xiàn)象,其兩次給藥血液清除速率一致,無第二次給藥肝臟富集增多的現(xiàn)象產(chǎn)生,從而不影響第二次給藥的siRNA藥物在腫瘤組織的富集,是同次給藥DSPE-PEG 2000組的1.3倍。在細(xì)胞水平,PCB修飾可以有效促進(jìn)siRNA藥物的內(nèi)涵體逃逸能力,使siRNA藥物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮藥效。因此,在腫瘤治療方面,DSPE-PCB20陽離子脂質(zhì)體負(fù)載針對Polo樣激酶1(Polo-like kinase 1,Plkl)的siRNA藥物siPlk1可以有效沉默目標(biāo)蛋白Plk1的表達(dá),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而抑制腫瘤生長,在腫瘤治療中具有很好的應(yīng)用前景。(3)設(shè)計合成了PCB修飾的喜樹堿(Camptothecin, CPT)前藥類脂質(zhì)分子CPT-PCBn,用于制備雙重敏感程序可控釋放的陽離子脂質(zhì)體siRNA藥物和CPT化療藥物的聯(lián)合給藥輸遞體系。實驗首先通過酯鍵連接制備了PCB修飾的CPT前藥類脂質(zhì)分子CPT-PCBn,結(jié)合陽離子脂質(zhì)DDAB,制備CPT-PCBn前藥陽離子脂質(zhì)體siRNA藥物輸遞體系。CPT-PCBn前藥陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物不僅提高了藥物的穩(wěn)定性和載藥率,同時具有雙重敏感程序可控釋放的性質(zhì)。首先,PCB分子在內(nèi)涵體酸性條件下質(zhì)子化,加快siRNA藥物的內(nèi)涵體逃逸,使其在與細(xì)胞孵育4h時高效釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。其次,CPT-PCBn勺酯鍵連接基團(tuán)具有酸性和酯酶敏感性,在細(xì)胞內(nèi)涵體和細(xì)胞質(zhì)中利用酸性或酯酶響應(yīng)斷裂,12h時持續(xù)釋放CPT進(jìn)入細(xì)胞核。由于siPlkl首先釋放下調(diào)Plkl蛋白的表達(dá)可以促進(jìn)HeLa腫瘤細(xì)胞對CPT的敏感性,因此,CPT-PCBn前藥陽離子脂質(zhì)體/siPlkl復(fù)合物在體外和體內(nèi)均具有很好的協(xié)同腫瘤抑制效果,在腫瘤治療中具有很好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：小干擾RNA 聚羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯 陽離子脂質(zhì)體 內(nèi)涵體逃逸 加快血液清除現(xiàn)象
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(過程工程研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TQ460.1
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-16
• 1 文獻(xiàn)綜述16-44
• 1.1 引言16
• 1.2 siRNA治療藥物簡介16-20
• 1.2.1 siRNA的作用機(jī)制16-18
• 1.2.2 siRNA藥物分子的研發(fā)及應(yīng)用18-20
• 1.2.3 siRNA藥物應(yīng)用中存在的問題20
• 1.3 siRNA藥物的輸遞體系20-34
• 1.3.1 病毒載體21-23
• 1.3.2 非病毒載體23-34
• 1.3.2.1 陽離子脂質(zhì)體23-28
• 1.3.2.2 合物28-30
• 1.3.2.3 枝狀大分子30-32
• 1.3.2.4 無機(jī)納米載體32-34
• 1.4 siRNA藥物輸遞障礙及解決方法34-38
• 1.4.1 siRNA藥物的高效包載34
• 1.4.2 血液穩(wěn)定性34-35
• 1.4.3 細(xì)胞內(nèi)吞35
• 1.4.4 內(nèi)涵體逃逸35
• 1.4.5 病因復(fù)雜性35
• 1.4.6 PEG在克服輸遞體系障礙中的應(yīng)用35-38
• 1.5 兩性離子聚合物抗非特異性蛋白吸附材料38-40
• 1.6 立題依據(jù)及研究目標(biāo)40-44
• 1.6.1 論文立題依據(jù)40-41
• 1.6.2 論文工作目標(biāo)41-44
• 2 DSPE-PCB_n修飾的新型長循環(huán)陽離子脂質(zhì)體用于siRNA藥物的遞送44-74
• 2.1 引言44-45
• 2.2 實驗方法45-54
• 2.2.1 實驗材料及藥品45-46
• 2.2.2 細(xì)胞與動物46
• 2.2.3 實驗儀器46
• 2.2.4 DSPE-PCB_n脂質(zhì)分子的合成與表征46-48
• 2.2.5 陽離子脂質(zhì)體和復(fù)合物的制備與表征48-49
• 2.2.6 瓊脂糖凝膠電泳49
• 2.2.7 siRNA藥物包埋率的測定49-50
• 2.2.8 DSPE-PCB_n陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的血清穩(wěn)定性50
• 2.2.9 DSPE-PCB_n陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞毒性50
• 2.2.10 流式細(xì)胞儀測定復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞50
• 2.2.11 激光掃描共聚焦顯微鏡測定復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞和內(nèi)涵體逃逸50-51
• 2.2.12 IN Cell Analyzer 2000測定復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸能力51
• 2.2.13 DSPE-PCB_n陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的pH敏感性測定51
• 2.2.14 熒光共振能力轉(zhuǎn)移實驗51-52
• 2.2.15 DSPE-PCB_n陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的體外作用效果52
• 2.2.16 DSPE-PCB_n陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的生物分布測定52-53
• 2.2.17 DSPE-PCB_n陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的體內(nèi)作用效果53
• 2.2.18 數(shù)據(jù)分析53-54
• 2.3 結(jié)果與討論54-71
• 2.3.1 DSPE-PCB_n脂質(zhì)分子的表征54-55
• 2.3.2 陽離子脂質(zhì)體和復(fù)合物的物理化學(xué)表征55-57
• 2.3.3 陽離子脂質(zhì)體對siRNA藥物的復(fù)合能力57-59
• 2.3.4 DSPE-PCB_n陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的血清穩(wěn)定性59-60
• 2.3.5 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的生物相容性60-61
• 2.3.6 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞61-63
• 2.3.7 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸能力63-66
• 2.3.8 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的酸性敏感性66-67
• 2.3.9 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的內(nèi)涵體膜擾動能力67-68
• 2.3.10 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的體外基因沉默效果68-69
• 2.3.11 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的體內(nèi)生物分布69-70
• 2.3.12 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的體內(nèi)作用效果70-71
• 2.4 本章小結(jié)71-74
• 3 避免ABC現(xiàn)象的DSPE-PCB_n長循環(huán)陽離子脂質(zhì)體用于腫瘤治療74-104
• 3.1 引言74-75
• 3.2 實驗材料與方法75-84
• 3.2.1 實驗試劑75-76
• 3.2.2 細(xì)胞與動物76
• 3.2.3 實驗儀器76
• 3.2.4 陽離子脂質(zhì)體和復(fù)合物的制備與表征76-77
• 3.2.5 siRNA藥物包埋率的測定77
• 3.2.6 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的血清穩(wěn)定性77
• 3.2.7 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞毒性77-78
• 3.2.8 流式細(xì)胞儀測定復(fù)合物的入胞能力和機(jī)制78
• 3.2.9 陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸能力測定78-79
• 3.2.10 定量siRNA藥物的細(xì)胞內(nèi)釋放79
• 3.2.11 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的pH敏感性測定79
• 3.2.12 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的藥物動力學(xué)79-80
• 3.2.13 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的臟器分布80-81
• 3.2.14 血液中IgM和IgG蛋白的測定81-82
• 3.2.15 陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的腫瘤分布82-83
• 3.2.16 陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的腫瘤抑制效果83-84
• 3.2.17 數(shù)據(jù)分析84
• 3.3 結(jié)果與分析84-102
• 3.3.1 陽離子脂質(zhì)體及復(fù)合物的表征84-87
• 3.3.2 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的血清穩(wěn)定性87-88
• 3.3.3 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞毒性88-89
• 3.3.4 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的藥物動力學(xué)性質(zhì)89-90
• 3.3.5 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的肝、脾臟分布90-91
• 3.3.6 血漿中IgM和IgG蛋白濃度變化水平測定91-93
• 3.3.7 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的腫瘤分布93-96
• 3.3.8 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞作用96-97
• 3.3.9 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸97-99
• 3.3.10 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的體內(nèi)腫瘤抑制效果99-100
• 3.3.11 DSPE-PCB_(20)陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物靶基因沉默效果100-101
• 3.3.12 TUNEL腫瘤組織細(xì)胞凋亡檢測101-102
• 3.4 本章小結(jié)102-104
• 4 程序釋放CPT-PCB_n前藥脂質(zhì)體siRNA藥物輸遞體系用于腫瘤治療104-146
• 4.1 引言104-106
• 4.2 實驗儀器與方法106-117
• 4.2.1 實驗材料與藥品106-107
• 4.2.2 細(xì)胞與動物107
• 4.2.3 實驗儀器107
• 4.2.4 CPT-PCB_n類脂質(zhì)分子的合成與表征107-110
• 4.2.5 臨界膠束濃度的測定110-111
• 4.2.6 CPT-PCB_n陽離子脂質(zhì)體及復(fù)合物的制備與表征111
• 4.2.7 CPT及siRNA藥物包埋率和載藥率的測定111-112
• 4.2.8 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的血清穩(wěn)定性112
• 4.2.9 CPT的藥物釋放112
• 4.2.10 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的pH敏感性112-113
• 4.2.11 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞能力和機(jī)制113
• 4.2.12 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸113-114
• 4.2.13 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)藥物釋放114
• 4.2.14 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的靶基因沉默效果114
• 4.2.15 測定CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力114
• 4.2.16 測定CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞毒性114-115
• 4.2.17 CPT的藥物動力學(xué)測定115
• 4.2.18 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的生物分布測定115-116
• 4.2.19 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的腫瘤抑制效果116-117
• 4.2.20 數(shù)據(jù)分析117
• 4.3 結(jié)果與分析117-144
• 4.3.1 CPT-PCBn類脂質(zhì)分子的表征117-121
• 4.3.2 CPT-PCB_n質(zhì)分子的臨界膠束濃度121
• 4.3.3 CPT陽離子脂質(zhì)體及復(fù)合物的物理化學(xué)表征121-125
• 4.3.4 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的血清穩(wěn)定性125-126
• 4.3.5 CPT在不同環(huán)境中的藥物釋放126-127
• 4.3.6 PCB和PMPC修飾復(fù)合物的質(zhì)子緩沖能力127-128
• 4.3.7 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)吞和機(jī)制128-131
• 4.3.8 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸131-134
• 4.3.9 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)藥物釋放134
• 4.3.10 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞水平基因沉默效果134-136
• 4.3.11 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞水平抑制效果136-138
• 4.3.12 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的藥物動力學(xué)和生物分布138-141
• 4.3.13 CPT陽離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的體內(nèi)腫瘤抑制效果141-144
• 4.4 本章小結(jié)144-146
• 5 結(jié)論和展望146-150
• 5.1 引言146
• 5.2 主要結(jié)論146-148
• 5.3 創(chuàng)新點總結(jié)148
• 5.4 今后的工作建議148-150
• 參考文獻(xiàn)150-162
• 主要符號表162-164
• 個人簡歷及發(fā)表文章目錄164-166
• 致謝166

  本文關(guān)鍵詞：基于兩性離子載體材料的小干擾RNA藥物輸遞體系的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：263691