本文關(guān)鍵詞：微球型魔芋葡甘聚糖生物材料的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及調(diào)控，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：魔芋葡甘聚糖(KGM)是一種水溶性植物多糖,具有良好的生物相容性,具備作為理想生物材料的優(yōu)良特性。本課題以魔芋粗粉為原料,提取精制出KGM,制備出KGM微球顆粒,建立了完整的制備工藝,用于生物分離介質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)微載體。采用醇洗的方法制備了純度在85%以上的KGM精粉,去除了魔芋粗粉中含有的絕大部分可溶性雜質(zhì),包括可溶性糖、色素和粗蛋白等。此外,針對KGM水溶液粘度大(2320 mPa.s,1% KGM)、難以分散成球的不足,選用化學(xué)降解法,對KGM分子進(jìn)行了降解,降解后的KGM分子量集中在20 kD-40 kD,粘度下降至200～300 mPa.s(12%KGM)。采用攪拌懸浮法制備了兩種不同交聯(lián)度(25%和50%)的KGM脫鹽微球介質(zhì),兩種微球形貌規(guī)整,篩分后的平均粒徑為150μm。兩種KGM微球?qū)η驙畹鞍椎姆蛛x范圍分別為1 kD-10 kD和4 kD-30 kD。利用這兩種KGM微球介質(zhì)對蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行了脫鹽,最終獲得的蛋白回收率均在95%以上,脫鹽效果與商品化葡聚糖介質(zhì)相當(dāng)。經(jīng)測定,KGM微球介質(zhì)具有優(yōu)良的物理化學(xué)穩(wěn)定性,耐受高溫高壓,在多種常用的液體緩沖液中能夠保持穩(wěn)定。對KGM微球用二乙氨乙基鹽酸(DEAE-HCl)進(jìn)行修飾,制備了細(xì)胞培養(yǎng)微載體。利用響應(yīng)曲面法對影響微載體上細(xì)胞生長密度的微載體粒徑、配基密度、魔芋濃度、交聯(lián)度的最佳水平范圍進(jìn)行了研究。通過對二次多項(xiàng)回歸方程求解得到九組預(yù)測參數(shù)。根據(jù)實(shí)際操作條件以及進(jìn)一步細(xì)胞培養(yǎng)驗(yàn)證,得到了最佳工藝條件為魔芋濃度為12%,交聯(lián)度為25%,粒徑大小]60-212μm,配基添加量為0.5 g/g,將這種優(yōu)化后的KGM微載體命名為A-KGM-1225。靜態(tài)培養(yǎng)中,Vero細(xì)胞在A-KGM-1225上鋪展迅速；培養(yǎng)48 h后的激光共聚焦結(jié)果顯示,Vero細(xì)胞在A-KGM-1225上的肌動(dòng)蛋白表達(dá)量比在商品化葡聚糖微載體上表達(dá)得更多。微載體的懸浮培養(yǎng)中,A-KGM-1225上Vero細(xì)胞的平臺期比葡聚糖微載體上細(xì)胞的平臺期要晚1天。細(xì)胞在培養(yǎng)6天以后,A-KGM-1225上的細(xì)胞具有更高的糖耗,表現(xiàn)了更強(qiáng)的增殖能力。所有研究結(jié)果證實(shí),經(jīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)得到的A-KGM-1225,比商品化以葡聚糖為基質(zhì)的Cytodex-1更有利于細(xì)胞的貼附和增殖。為了解決傳統(tǒng)方法制備微球粒徑分布較寬、產(chǎn)品收率低且重復(fù)性差等不足,采用快速膜乳化法制備了粒徑小于10μm的且粒徑均一的KGM微球。利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了不同的油相組成、表面活性劑用量、不同油水比例以及不同交聯(lián)轉(zhuǎn)速對微球粒徑均一性的影響,得出了快速膜乳化法制備微球工藝的最佳方案。在優(yōu)化的條件下,獲得的KGM微球的span值為0.9,平均粒徑小于10μm。
【關(guān)鍵詞】：魔芋葡甘聚糖 凝膠層析 微載體 膜乳化
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(過程工程研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：O636.1
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 1 文獻(xiàn)綜述14-50
• 1.1 魔芋葡甘聚糖14-20
• 1.1.1 葡甘聚糖的來源14-15
• 1.1.2 魔芋葡甘聚糖的分類15
• 1.1.3 分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)15-17
• 1.1.4 傳統(tǒng)及現(xiàn)代應(yīng)用17-19
• 1.1.5 精粉的制備特性19
• 1.1.6 高純魔芋葡甘聚糖與普通魔芋葡甘聚糖精粉的比較19-20
• 1.1.7 魔芋葡甘聚糖的高值化研究20
• 1.2 凝膠過濾層析技術(shù)20-26
• 1.2.1 層析技術(shù)的分類21-23
• 1.2.2 凝膠層析的應(yīng)用23-25
• 1.2.3 常見的商品化凝膠介質(zhì)25-26
• 1.3 細(xì)胞培養(yǎng)微載體26-40
• 1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展史26-27
• 1.3.2 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方法27
• 1.3.3 微載體的發(fā)展27-28
• 1.3.4 微載體培養(yǎng)的特點(diǎn)28
• 1.3.5 微載體分類28-31
• 1.3.6 微載體特性對細(xì)胞培養(yǎng)的影響31-33
• 1.3.7 微載體的表面修飾33-35
• 1.3.8 細(xì)胞與材料的相互作用35-40
• 1.4 微孔膜乳化技術(shù)40-47
• 1.4.1 傳統(tǒng)乳液制備方法及其缺點(diǎn)40-41
• 1.4.2 微孔膜乳化41-47
• 1.5 論文的立題思路47-50
• 2 魔芋葡甘聚糖的純化及降解50-64
• 2.1 引言50
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備50-51
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料及藥品50
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備50-51
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法51-54
• 2.3.1 魔芋葡甘聚糖的精純51
• 2.3.2 DNS試劑的配制51-52
• 2.3.3 魔芋葡甘聚糖含量測定52-53
• 2.3.4 魔芋葡甘聚糖化學(xué)基團(tuán)的檢測(FT-IR)53
• 2.3.5 魔芋葡甘聚糖分子水溶液降解行為研究53
• 2.3.6 魔芋葡甘聚糖的化學(xué)法降解53-54
• 2.3.7 魔芋葡甘聚糖漿液的粘度測定54
• 2.3.8 魔芋葡甘聚糖分子量測定54
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論54-61
• 2.4.1 魔芋精粉的精制54-56
• 2.4.2 魔芋葡甘聚糖精粉的紅外光譜分析56
• 2.4.3 魔芋葡甘聚糖分子水溶液降解行為研究56-58
• 2.4.4 魔芋葡甘聚糖漿液的質(zhì)量控制58-59
• 2.4.5 降解后魔芋葡甘聚糖漿液的分子量分布59-61
• 2.5 本章小結(jié)61-64
• 3 魔芋葡甘聚糖小分子分離介質(zhì)的制備及應(yīng)用64-80
• 3.1 引言64-65
• 3.2 材料與設(shè)備65
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料65
• 3.2.2 主要儀器設(shè)備65
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法65-68
• 3.3.1 魔芋葡甘聚糖微球的制備66
• 3.3.2 微球性能檢測66-67
• 3.3.3 微球脫鹽試驗(yàn)67
• 3.3.4 魔芋葡甘聚糖微球介質(zhì)的穩(wěn)定性研究67-68
• 3.4 結(jié)果與討論68-78
• 3.4.1 魔芋葡甘聚糖微球的含水量68
• 3.4.2 魔芋葡甘聚糖微球外觀觀察68-70
• 3.4.3 耐壓和流速70-72
• 3.4.4 魔芋葡甘聚糖凝膠的分離范圍72-74
• 3.4.5 蛋白質(zhì)脫鹽試驗(yàn)74-77
• 3.4.6 凝膠微球的穩(wěn)定性分析77-78
• 3.5 本章小結(jié)78-80
• 4 魔芋葡甘聚糖微載體的制備及應(yīng)用80-108
• 4.1 引言80-81
• 4.2 材料與設(shè)備81-82
• 4.2.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)基81
• 4.2.2 主要材料與試劑81-82
• 4.2.3 主要設(shè)備82
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法82-85
• 4.3.1 不同骨架密度的魔芋葡甘聚糖微球的制備82
• 4.3.2 微球的胺化82-83
• 4.3.3 魔芋葡甘聚糖微載體表面形貌觀察83
• 4.3.4 魔芋葡甘聚糖微球電荷密度測定83
• 4.3.5 材料表面化學(xué)基團(tuán)的檢測(FT-IR)83
• 4.3.6 魔芋葡甘聚糖微載體的預(yù)處理83-84
• 4.3.7 細(xì)胞靜態(tài)培養(yǎng)84
• 4.3.8 Vero細(xì)胞在微載體表面的核及骨架染色84
• 4.3.9 不同骨架密度的魔芋葡甘聚糖細(xì)胞培養(yǎng)微載體對血清蛋白的吸附84
• 4.3.10 Vero細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)84-85
• 4.3.11 五種細(xì)胞系在魔芋葡甘聚糖微載體上生長85
• 4.3.12 統(tǒng)計(jì)分析85
• 4.4 結(jié)果與討論85-106
• 4.4.1 不同配基密度的魔芋葡甘聚糖微載體對細(xì)胞培養(yǎng)的影響85-87
• 4.4.2 不同粒徑大小的魔芋葡甘聚糖微載體對細(xì)胞培養(yǎng)的影響87
• 4.4.3 不同骨架密度的魔芋葡甘聚糖微載體對細(xì)胞培養(yǎng)的影響87-89
• 4.4.4 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)89-94
• 4.4.5 微載體表面形貌94-96
• 4.4.6 魔芋葡甘聚糖微載體對血清蛋白的吸附性96-97
• 4.4.7 魔芋葡甘聚糖微載體表面的化學(xué)基團(tuán)97
• 4.4.8 Vero細(xì)胞在材料表面的形態(tài)觀察及分析97
• 4.4.9 Vero細(xì)胞在材料表面的核及骨架染色97-99
• 4.4.10 Vero細(xì)胞在載體上的貼附動(dòng)力學(xué)99-100
• 4.4.11 細(xì)胞在載體表面生長過程檢測100-101
• 4.4.12 五種細(xì)胞系在載體的空球率101-102
• 4.4.13 五種細(xì)胞在微載體上的生長及新陳代謝102-106
• 4.5 本章小節(jié)106-108
• 5 微孔膜乳化法制備魔芋葡甘聚糖微球108-128
• 5.1 前言108
• 5.2 材料和儀器108-110
• 5.2.1 主要材料108-109
• 5.2.2 主要設(shè)備109-110
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法110-112
• 5.3.1 微孔膜的修飾110-111
• 5.3.2 粘度的測定111
• 5.3.3 油水相界面張力的測定111
• 5.3.4 快速膜乳化法制備魔芋葡甘聚糖微球111
• 5.3.5 魔芋葡甘聚糖微球粒徑分布的測定111
• 5.3.6 正交實(shí)驗(yàn)111-112
• 5.4 結(jié)果與討論112-126
• 5.4.1 常規(guī)膜乳化112-115
• 5.4.2 快速膜乳化115-126
• 5.5 本章小結(jié)126-128
• 6 結(jié)論與展望128-132
• 6.1 主要研究結(jié)論128-129
• 6.2 本論文的創(chuàng)新點(diǎn)129-130
• 6.3 展望130-132
• 參考文獻(xiàn)132-142
• 個(gè)人簡歷及發(fā)表文章目錄142-144
• 致謝144

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