發(fā)布時間：2018-03-21 09:42

  本文選題：D-甘露糖異構(gòu)酶　切入點：D-甘露糖　出處：《江南大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：D-甘露糖是一種常見的食品營養(yǎng)補(bǔ)充劑,具有調(diào)節(jié)血糖反應(yīng)和促進(jìn)腸道健康等作用,也是部分免疫刺激劑、維生素、甘露醇等生物制劑的起始合成材料。游離D-甘露糖在自然界中存在較少,直接提取法受到原料和季節(jié)的限制,而化學(xué)合成法因副產(chǎn)物多民眾接受度低。因此,生物酶法合成D-甘露糖成為新的發(fā)展趨勢,本研究主要目的是獲得D-甘露糖異構(gòu)酶高產(chǎn)菌株,用于大規(guī)模生產(chǎn)制備D-甘露糖。從腐爛水果中分離、篩選出一株D-甘露糖異構(gòu)酶產(chǎn)生菌Pseudomonas sp.SK27.016,保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC),編號為CCTCC NO:M2014411。利用HPLC、LC-MS、1H NMR和FT-IR進(jìn)行產(chǎn)物鑒定,確定該菌全細(xì)胞催化D-果糖的主要產(chǎn)物為D-甘露糖。收集Pseudomonas sp.SK27.016菌體超聲破碎上清作為粗酶液,經(jīng)硫酸銨分級沉淀、Hi Trap Q HP陰離子交換柱層析、Hi Trap Phenyl FF[HS]疏水柱層析等步驟,獲得的D-甘露糖異構(gòu)酶經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示為單一條帶。通過酶學(xué)性質(zhì)研究,該酶的最適溫度為40°C,最適p H 8.0;純酶在4°C儲存6個月可以保持90%以上的酶活;同時該酶也是非金屬依賴酶,Zn2+、Ni2+和Cu2+能強(qiáng)烈抑制酶活。在最適條件下,D-果糖和D-甘露糖的平衡比率約為75:25,催化D-果糖的動力學(xué)參數(shù)Km為224.27 m M,kcat為21.67 s 1,催化效率(kcat/Km)為96.63 s 1 M 1。為獲得更好的產(chǎn)酶菌株,選定來源于大腸桿菌的D-甘露糖異構(gòu)酶基因yih S進(jìn)行同源克隆表達(dá),構(gòu)建了兩個工程菌:E.coli BL21/p ET20b(+)-yih S和E.coli BL21/p ET28a(+)-yih S。兩個工程菌均表達(dá)活性D-甘露糖異構(gòu)酶,但p ET28a(+)更適合yih S的表達(dá),產(chǎn)生出大量可溶性胞內(nèi)酶蛋白。E.coli BL21/p ET28a(+)-yih S在28°C條件下加入1 m M IPTG誘導(dǎo)6 h酶表達(dá)量最高,胞內(nèi)發(fā)酵酶活約為4.8 U/m L。將大腸桿菌的D-甘露糖異構(gòu)酶基因yih S利用B.subtilis進(jìn)行表達(dá),成功構(gòu)建菌株B.subtilis 168/p MA5-yih S和B.subtilis WB800/p MA5-yih S。在Hpa II啟動子作用下,該重組菌株無需誘導(dǎo)即可產(chǎn)生MIase酶;優(yōu)化發(fā)酵條件后,將重組菌在小型發(fā)酵罐(3.0 L)內(nèi)采用補(bǔ)料分批發(fā)酵策略,39 h時發(fā)酵上清酶活高達(dá)51.2 U/m L,是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的10.7倍左右。將發(fā)酵得到的1.3 L酶液過濾分離收集上清,獲得MIase粗酶液,超濾濃縮至五分之一體積后凍干,可制成6.7 g淡灰色粗酶粉。在1 g/L粗酶粉作用下,150 g/L的D-甘露糖可由600 g/L的底物D-果糖轉(zhuǎn)化兩小時獲得,轉(zhuǎn)化率約為25%,時空產(chǎn)率(Space time yield,STY)約為75 g D-甘露糖/L/h。通過DEAE離子交換柱層析對B.subtilis WB800/p MA5-yih S表達(dá)的MIase酶進(jìn)行分離純化,其亞基分子量約為45 k Da,酶蛋白分子量為275 k Da。重組D-甘露糖異構(gòu)酶催化D-果糖的最適溫度為45°C,最適p H為7.0,酶學(xué)性質(zhì)與Pseudomonas sp.SK27.016MIase相比,最適溫度提高了5°C,p H偏向中性;Co2+、Ni2+和Zn2+對酶活有明顯抑制作用,而Cu2+可使酶完全失活;該重組酶催化D-果糖的動力學(xué)參數(shù)Km為203.7±6.7 m M,Vmax為0.6μM s 1 mg 1,kcat為27.7±0.7 s 1,催化效率(kcat/Km)為136.0±2.9 s 1 M 1,和Pseudomonas sp.SK27.016相比催化效率有所提高。利用B.subtilis 168來源的組成型強(qiáng)啟動子P43與yih S基因通過重疊延伸PCR技術(shù)融合,通過雙交換整合將P43-yih S表達(dá)框和lox71-Spc-lox66基因框整合至B.subtilis1A751染色體上的淀粉酶基因位點,然后利用Cre/lox P系統(tǒng)敲除抗性基因,成功構(gòu)建食品級重組菌株B.subtilis 1A751/lox-P43-yih S,在啟動子P43的作用下,E.coli來源的MIase酶基因yih S在對數(shù)期及穩(wěn)定期均可表達(dá),發(fā)酵14 h OD600值約為5.6,發(fā)酵16 h酶活約為3.5 U/m L,較重組菌B.subtilis WB800/p MA5-yih S要低,但表達(dá)穩(wěn)定性較好。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TQ929;TS218

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1643301