本文關(guān)鍵詞： L-鳥氨酸 精氨酸酶 生物轉(zhuǎn)化 枯草芽孢桿菌 食品級　出處：《江南大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：L-鳥氨酸是尿素循環(huán)中的重要中間代謝產(chǎn)物,在人體中是一種非必需氨基酸。L-鳥氨酸因具有保肝護肝、減肥保健、抗疲勞、促進傷口愈合和抑制苦味等多種生理功能而被廣泛應用于食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域。精氨酸酶可以水解L-精氨酸生成L-鳥氨酸及尿素。相比于其他L-鳥氨酸生產(chǎn)方法,酶法生產(chǎn)具有催化效率高、反應副產(chǎn)物少、專一性強等優(yōu)點。目前工業(yè)化生產(chǎn)L-鳥氨酸的精氨酸酶多取自于動物肝臟,而微生物來源的精氨酸酶豐富且成本較低,開發(fā)微生物精氨酸酶資源具有很大的應用潛力。酶法生產(chǎn)以成本相對較高的L-精氨酸為底物,需要進一步提高底物轉(zhuǎn)化效率來降低成本。基因工程菌的抗生素耐藥性已是全球性問題,選用安全宿主和構(gòu)建無抗生素抗性基因的工程菌株是未來精氨酸酶工程菌株的發(fā)展方向。本研究通過菌株的篩選,得到了一株精氨酸酶高產(chǎn)菌株Rummeliibacillus pycnus SK31.001,并以此菌株為出發(fā)菌株分離純化出了精氨酸酶蛋白;利用PCR技術(shù)推導出精氨酸酶的編碼基因序列,成功將該基因在大腸桿菌中克隆表達;對精氨酸酶的酶學性質(zhì)進行研究,構(gòu)建了精氨酸酶與脲酶的雙酶反應體系;實現(xiàn)了精氨酸酶在枯草芽孢桿菌中的多拷貝、無抗生素抗性基因的整合表達,為L-鳥氨酸的食品級生產(chǎn)奠定了應用基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)在菌株篩選中,添加L-精氨酸以誘導精氨酸酶合成,利用HPLC對L-鳥氨酸進行鑒定并分析發(fā)酵菌體轉(zhuǎn)化L-精氨酸的能力,選取了R.pycnus SK31.001為初始菌株。利用正丙醇沉淀、DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換色譜和Superdex 200凝膠層析對精氨酸酶進行分離純化,得到了電泳純的酶液,比酶活為256.2 U/mg。SDS-PAGE和凝膠排阻色譜分析純化的精氨酸酶蛋白質(zhì),亞基分子量為34 k Da,蛋白分子量為196 k Da,證明來自于R.pycnus的精氨酸酶為六聚體結(jié)構(gòu)。根據(jù)不同來源的精氨酸酶氨基酸序列的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物,利用簡并PCR擴增出R.pycnus精氨酸酶基因的部分序列,長度達717 bp。根據(jù)已知的部分序列設(shè)計反向引物,利用反向PCR技術(shù)擴增已知序列的翼側(cè)未知部分,將得到的序列與已知序列進行拼接,推導出R.pycnus精氨酸酶基因的ORF框,共906 bp。提交至NCBI,獲得登錄號為:KP702726。對比不同來源的精氨酸酶氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)R.pycnus精氨酸酶活性中心氨基酸殘基嚴格保守,Asp123,His125,Asp228,Asp230,His100和Asp127與中心雙離子相連,證明了所調(diào)取的基因編碼一種精氨酸酶。(2)將PCR擴增獲得的R.pycnus精氨酸酶基因插入p ET-28a(+)表達載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入宿主菌株,獲得重組菌株E.coli BL21(DE3)/p ET-28a(+)-arg。利用Ni~(2+)Sepharose 6 FF親和色譜柱成功純化出重組R.pycnus精氨酸酶,其亞基分子量約為34k Da,與野生菌純化結(jié)果相當。利用HPLC對酶反應產(chǎn)物進行分析,發(fā)現(xiàn)反應產(chǎn)物為L-鳥氨酸,確認克隆表達的基因序列為精氨酸酶序列。Mn~(2+)可以顯著增強R.pycnus精氨酸酶活力,當Mn~(2+)濃度達2 mmol/L時,精氨酸酶獲得最大酶活。R.pycnus精氨酸酶的最適反應p H為9.5,在p H 8.0-10.0間相對酶活較高且在p H 8.0-9.0條件下相對穩(wěn)定。最適反應溫度為80°C,在50°C下具有良好的熱穩(wěn)定性。在最適條件下比酶活達914U/mg,K_m、V_(max)、k_(cat)和k_(cat)/K_m值分別為0.212 mmol/L、1111 U/mg、629.6 s~(-1)及2910mmol/L/s。利用R.pycnus精氨酸酶進行生物轉(zhuǎn)化反應生產(chǎn)L-鳥氨酸,在200 g/L的底物濃度下,反應6 h,轉(zhuǎn)化率可達到95.2%。研究發(fā)現(xiàn),R.pycnus精氨酸酶可被Ni~(2+)激活。為進一步提高底物轉(zhuǎn)化率,除去反應中生成的副產(chǎn)物尿素,構(gòu)建了R.pycnus精氨酸酶和刀豆脲酶的雙酶反應體系。在添加Ni~(2+)的條件下,精氨酸酶與脲酶均在p H 6.5和40-50°C間有著較高酶活,在p H 6.0-8.0和40-50°C條件下具有較好的穩(wěn)定性。雙酶轉(zhuǎn)化L-精氨酸,反應反應3 h,轉(zhuǎn)化率可達到99.7%且無尿素殘留。(3)利用重疊延伸PCR技術(shù),將枯草芽孢桿菌中的P43啟動子與R.pycnus精氨酸酶基因融合以增強精氨酸酶的表達。利用定點整合與隨機整合表達的方法將表達單元P43-arg與lox71-spc-lox66抗性基因表達盒分別插入arg I基因被敲除的枯草芽孢桿菌BSKA染色體的amy E、thr C位點和未知的位點中,成功構(gòu)建了2、2、2、3拷貝數(shù)的重組菌株。利用原生質(zhì)轉(zhuǎn)化技術(shù),對重組菌株進行染色體重排,利用Cre/lox重組系統(tǒng)將染色體上的抗生素抗性基因敲除,最終成功構(gòu)建了9拷貝數(shù)的重組菌株BSKA-C3,發(fā)酵酶活可達14.5 U/m L。利用全細胞轉(zhuǎn)化L-精氨酸生成L-鳥氨酸,轉(zhuǎn)化8 h,L-鳥氨酸濃度達到145.8 g/L,摩爾轉(zhuǎn)化率達96.1%�？疾熘亟M菌株的整合穩(wěn)定性,傳代10次發(fā)酵酶活沒有下降,說明重組菌株BSKA-C3具有良好的整合穩(wěn)定性。
[Abstract]:L - ornithine is an important intermediate metabolite in urea cycle , it is a non - essential amino acid in human body . A total of 906 bp was obtained . The accession number of the amino acid residues from different sources was obtained by the submission of the amino acid sequence from different sources . Asp123 , His125 , Asp228 , Asp230 , His100 and Asp127 were linked to the double - ion of the center . coli BL21 ( DE3 ) / p - ET - 28a ( + ) - arginine was successfully purified by using Ni ~ ( 2 + ) Sepharose 6 FF affinity chromatography column . The recombinant strain BSKA - C3 was successfully constructed by using protoplast transformation technique .

【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TQ922

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 盧冬梅;劉建忠;毛宗萬;;基因敲除谷氨酸棒桿菌提高鳥氨酸產(chǎn)量及比較蛋白質(zhì)組學分析(英文)[J];Chinese Journal of Chemical Engineering;2012年04期

2 張鵬;徐燾;張驍;陳暢;;酶法生產(chǎn)鳥氨酸菌株的篩選與培養(yǎng)[J];北京化工大學學報(自然科學版);2009年06期

3 陳曉月;金寧一;鄒偉;海洋;馬海利;李昌;;枯草芽孢桿菌啟動子序列在大腸桿菌中的克隆及序列分析[J];沈陽農(nóng)業(yè)大學學報;2008年03期

4 丁一娟,于皆平,羅和生,葉惠鳳;門冬氨酸鳥氨酸治療肝硬化并肝性腦病及肝功能異常[J];中國醫(yī)院藥學雜志;2005年07期

5 潘韻,陳寧;微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥氨酸[J];生物技術(shù)通訊;2000年01期

6 任立明，，陳永福;用隨機整合法在芽孢桿菌中表達高溫α－淀粉酶基因[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報;1994年01期

7 陳乃用;枯草芽孢桿菌中質(zhì)粒的穩(wěn)定性問題[J];微生物學通報;1993年04期

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本文編號：1446793