本文關(guān)鍵詞：葡萄根系產(chǎn)褪黑素內(nèi)生細(xì)菌的篩選及其合成路徑的研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：褪黑素(Melatonin,MEL)是一種動(dòng)植物和單細(xì)胞生物中普遍具有的色氨酸衍生物,它擁有獨(dú)特的抗氧化和生理調(diào)節(jié)的功能。外源應(yīng)用MEL能夠促進(jìn)植物種子發(fā)芽,根系發(fā)育、開(kāi)花以及果實(shí)成熟,同時(shí)也能防止葉片衰老,在生物和非生物逆境脅迫下提高植物的耐受能力。前人的研究表明,非生物脅迫能夠提高植物內(nèi)源MEL的合成,這是由于逆境脅迫下植物產(chǎn)生的活性氧類物質(zhì)(Reactive oxygen species;ROS)激活了植物MEL的生物合成。在自然條件下,陸地植物的根系聚集著豐富的內(nèi)生微生物,它們能夠與宿主植物互相作用,并調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。內(nèi)生菌是植物生長(zhǎng)發(fā)育的根系有益組分,它們往往具有合成植物激素的能力,并能夠改變宿主的內(nèi)源激素水平;然而,目前還沒(méi)有證據(jù)表明內(nèi)生菌能夠合成MEL,并且憑此能力,影響宿主植物的生理代謝。本研究從不同葡萄品種的根系內(nèi)分離、鑒定得到多種內(nèi)生細(xì)菌,隨后篩選出具有MEL合成能力的菌株。以高產(chǎn)MEL的菌株為材料,研究其對(duì)宿主植物逆境脅迫下內(nèi)源MEL水平和生長(zhǎng)發(fā)育的影響;通過(guò)~(15)N穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù),探討內(nèi)生細(xì)菌MEL生物合成路徑;采用原核表達(dá)和基因敲除手段,驗(yàn)證參與細(xì)菌MEL合成的L-苯丙氨酸羥化酶功能。主要研究結(jié)果如下:(1)采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方式并結(jié)合16S rDNA測(cè)序,從‘赤霞珠’,‘紅地球’,‘夏黑’以及中國(guó)野生山葡萄‘長(zhǎng)白九號(hào)’根系中分離內(nèi)生細(xì)菌,并對(duì)優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)測(cè)定菌株MEL的產(chǎn)生能力。結(jié)果顯示:4個(gè)葡萄品種根系中共分離得到內(nèi)生細(xì)菌6個(gè)屬,15個(gè)種;檢測(cè)到5株細(xì)菌具有MEL合成能力,分別為Bacillus amyloliquefaciens SB-9,Bacillus thuringiensis CS-9,Pseudomonas fluorescens RG11,Agrobacterium tumefaciens CS-30和Variovorax soli VA10,MEL合成能力在0.15 7.75ng/1012 cells之間。(2)選取MEL合成能力最強(qiáng)的內(nèi)生菌解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)SB-9和熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)RG11侵染不同葡萄品種幼苗根系,結(jié)果顯示,B.amyloliquefaciens SB-9和P.fluorescens RG11侵染葡萄幼苗顯著提高植株的鮮重,葉綠素含量,根長(zhǎng)度和側(cè)根數(shù)量等生長(zhǎng)指標(biāo),表現(xiàn)出優(yōu)良的生長(zhǎng)促進(jìn)作用;此外,在葡萄幼苗經(jīng)受干旱或者鹽脅迫時(shí),B.amyloliquefaciens SB-9和P.fluorescens RG11根系定殖顯著提高內(nèi)源MEL及其前體物的含量,降低葡萄色氨酸脫羧酶基因(VvTDCs)和5-羥色胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(VvSNAT)的轉(zhuǎn)錄水平;同時(shí)通過(guò)減少根系內(nèi)丙二醛(MDA)和活性氧的產(chǎn)生,抵御鹽和干旱脅迫帶來(lái)的不利影響。(3)采用~(15)N穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù),研究產(chǎn)MEL內(nèi)生細(xì)菌P.fluorescens RG11的MEL合成中間代謝產(chǎn)物組成以及合成規(guī)律。結(jié)果顯示,除了~(15)N-色胺以外,菌液中檢測(cè)到~(15)N-5-羥色氨酸、~(15)N-5-羥色胺、~(15)N-N-乙酰-5-羥色胺以及~(15)N-MEL的產(chǎn)生,表明此菌株MEL的合成途徑與動(dòng)物中相似,MEL合成的第一步反應(yīng)是~(15)N-L-色氨酸碳骨架被羥化形成5-羥色氨酸,推測(cè)細(xì)菌苯丙氨酸羥化酶(PAH)可能負(fù)責(zé)此菌株的色氨酸的羥基化;此外,P.fluorescens RG11的MEL合成能力在生長(zhǎng)期前期最高,培養(yǎng)后期急劇下降,推測(cè)MEL在細(xì)菌中可能是作為生長(zhǎng)信號(hào)因子或作為保護(hù)因子用于清除培養(yǎng)基中的ROS,以促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)早期的適應(yīng)性。(4)分析原核細(xì)菌苯丙氨酸羥化酶(PAH)與動(dòng)物氨基酸羥化酶(AAAHs)家族的親緣關(guān)系,同時(shí)克隆得到P.fluorescens RG11的PAH編碼基因,原核表達(dá)得到此菌株的PAH蛋白,通過(guò)酶活分析,在體外進(jìn)一步研究PAH對(duì)L-色氨酸的羥化能力,結(jié)果顯示:P.fluorescens RG11中PAH蛋白與動(dòng)物AAAHs家族蛋白存在較高的氨基酸序列相似性;體外酶活測(cè)試表明,純化的重組PAH蛋白同時(shí)具有L-色氨酸和L-苯丙氨酸羥化酶活性,能夠?qū)-色氨酸羥基化為5-羥基色氨酸,Km和V_(max)值分別為2575μM和0.834μmol 5-羥基色氨酸/min/mg蛋白,然而對(duì)L-色氨酸的親和力和羥化活力明顯低于羥化L-苯丙氨酸。(5)通過(guò)同源重組技術(shù),將P.fluorescens RG11控制合成PAH蛋白的phhA基因敲除,構(gòu)建?PhhA敲除菌株,隨后采用~(15)N同位素示蹤法和UPLC-MS/MS技術(shù),進(jìn)一步研究細(xì)菌PAH蛋白與MEL合成的關(guān)系,結(jié)果顯示:phhA基因敲除顯著降低了5-羥色氨酸以及后續(xù)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量;?PhhA菌株在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)期沒(méi)有檢測(cè)到MEL的產(chǎn)生,表明PAH負(fù)責(zé)RG11菌株5-羥色氨酸的合成,并在MEL的合成路徑中起到重要作用。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TS255.1

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