發(fā)布時間：2017-12-24 18:38

  本文關(guān)鍵詞：葡萄根系產(chǎn)褪黑素內(nèi)生細菌的篩選及其合成路徑的研究　出處：《西北農(nóng)林科技大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關(guān)文章： 內(nèi)生細菌 褪黑素 同位素示蹤法 逆境脅迫 合成路徑

【摘要】：褪黑素(Melatonin,MEL)是一種動植物和單細胞生物中普遍具有的色氨酸衍生物,它擁有獨特的抗氧化和生理調(diào)節(jié)的功能。外源應(yīng)用MEL能夠促進植物種子發(fā)芽,根系發(fā)育、開花以及果實成熟,同時也能防止葉片衰老,在生物和非生物逆境脅迫下提高植物的耐受能力。前人的研究表明,非生物脅迫能夠提高植物內(nèi)源MEL的合成,這是由于逆境脅迫下植物產(chǎn)生的活性氧類物質(zhì)(Reactive oxygen species;ROS)激活了植物MEL的生物合成。在自然條件下,陸地植物的根系聚集著豐富的內(nèi)生微生物,它們能夠與宿主植物互相作用,并調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育。內(nèi)生菌是植物生長發(fā)育的根系有益組分,它們往往具有合成植物激素的能力,并能夠改變宿主的內(nèi)源激素水平;然而,目前還沒有證據(jù)表明內(nèi)生菌能夠合成MEL,并且憑此能力,影響宿主植物的生理代謝。本研究從不同葡萄品種的根系內(nèi)分離、鑒定得到多種內(nèi)生細菌,隨后篩選出具有MEL合成能力的菌株。以高產(chǎn)MEL的菌株為材料,研究其對宿主植物逆境脅迫下內(nèi)源MEL水平和生長發(fā)育的影響;通過~(15)N穩(wěn)定同位素標記技術(shù),探討內(nèi)生細菌MEL生物合成路徑;采用原核表達和基因敲除手段,驗證參與細菌MEL合成的L-苯丙氨酸羥化酶功能。主要研究結(jié)果如下:(1)采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方式并結(jié)合16S rDNA測序,從‘赤霞珠’,‘紅地球’,‘夏黑’以及中國野生山葡萄‘長白九號’根系中分離內(nèi)生細菌,并對優(yōu)勢菌進行培養(yǎng),結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)測定菌株MEL的產(chǎn)生能力。結(jié)果顯示:4個葡萄品種根系中共分離得到內(nèi)生細菌6個屬,15個種;檢測到5株細菌具有MEL合成能力,分別為Bacillus amyloliquefaciens SB-9,Bacillus thuringiensis CS-9,Pseudomonas fluorescens RG11,Agrobacterium tumefaciens CS-30和Variovorax soli VA10,MEL合成能力在0.15 7.75ng/1012 cells之間。(2)選取MEL合成能力最強的內(nèi)生菌解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)SB-9和熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)RG11侵染不同葡萄品種幼苗根系,結(jié)果顯示,B.amyloliquefaciens SB-9和P.fluorescens RG11侵染葡萄幼苗顯著提高植株的鮮重,葉綠素含量,根長度和側(cè)根數(shù)量等生長指標,表現(xiàn)出優(yōu)良的生長促進作用;此外,在葡萄幼苗經(jīng)受干旱或者鹽脅迫時,B.amyloliquefaciens SB-9和P.fluorescens RG11根系定殖顯著提高內(nèi)源MEL及其前體物的含量,降低葡萄色氨酸脫羧酶基因(VvTDCs)和5-羥色胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(VvSNAT)的轉(zhuǎn)錄水平;同時通過減少根系內(nèi)丙二醛(MDA)和活性氧的產(chǎn)生,抵御鹽和干旱脅迫帶來的不利影響。(3)采用~(15)N穩(wěn)定同位素標記技術(shù),研究產(chǎn)MEL內(nèi)生細菌P.fluorescens RG11的MEL合成中間代謝產(chǎn)物組成以及合成規(guī)律。結(jié)果顯示,除了~(15)N-色胺以外,菌液中檢測到~(15)N-5-羥色氨酸、~(15)N-5-羥色胺、~(15)N-N-乙酰-5-羥色胺以及~(15)N-MEL的產(chǎn)生,表明此菌株MEL的合成途徑與動物中相似,MEL合成的第一步反應(yīng)是~(15)N-L-色氨酸碳骨架被羥化形成5-羥色氨酸,推測細菌苯丙氨酸羥化酶(PAH)可能負責此菌株的色氨酸的羥基化;此外,P.fluorescens RG11的MEL合成能力在生長期前期最高,培養(yǎng)后期急劇下降,推測MEL在細菌中可能是作為生長信號因子或作為保護因子用于清除培養(yǎng)基中的ROS,以促進細菌生長早期的適應(yīng)性。(4)分析原核細菌苯丙氨酸羥化酶(PAH)與動物氨基酸羥化酶(AAAHs)家族的親緣關(guān)系,同時克隆得到P.fluorescens RG11的PAH編碼基因,原核表達得到此菌株的PAH蛋白,通過酶活分析,在體外進一步研究PAH對L-色氨酸的羥化能力,結(jié)果顯示:P.fluorescens RG11中PAH蛋白與動物AAAHs家族蛋白存在較高的氨基酸序列相似性;體外酶活測試表明,純化的重組PAH蛋白同時具有L-色氨酸和L-苯丙氨酸羥化酶活性,能夠?qū)-色氨酸羥基化為5-羥基色氨酸,Km和V_(max)值分別為2575μM和0.834μmol 5-羥基色氨酸/min/mg蛋白,然而對L-色氨酸的親和力和羥化活力明顯低于羥化L-苯丙氨酸。(5)通過同源重組技術(shù),將P.fluorescens RG11控制合成PAH蛋白的phhA基因敲除,構(gòu)建?PhhA敲除菌株,隨后采用~(15)N同位素示蹤法和UPLC-MS/MS技術(shù),進一步研究細菌PAH蛋白與MEL合成的關(guān)系,結(jié)果顯示:phhA基因敲除顯著降低了5-羥色氨酸以及后續(xù)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量;?PhhA菌株在整個培養(yǎng)時期沒有檢測到MEL的產(chǎn)生,表明PAH負責RG11菌株5-羥色氨酸的合成,并在MEL的合成路徑中起到重要作用。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TS255.1

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