本文關鍵詞：菊糖果糖轉移酶晶體結構及超高壓對其構象和功能影響

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【摘要】：菊糖果糖轉移酶(IFTase)是生物法催化底物菊糖生成新型的功能性食品配料雙果糖苷III(DFAIII)的關鍵酶。目前,關于IFTase的研究多為野生菌的篩選,對于酶的結構了解甚少。蛋白的結構決定其功能,酶的催化功能是以酶分子高度特異性的結構為基礎實現(xiàn)的。因此,為了更好的提升IFTase的催化水平,促進對IFTase更深入的研究,有必要從分子水平上對IFTase的結構進行深入的探討。對IFTase結構的研究,不僅有助于加深對IFTase催化機理以及構效關系的理解,也有利于為以后IFTase理性設計、改造修飾提供理論基礎。本論文制備了IFTase以及IFTase-蔗果五糖復合物晶體,并對其空間結構進行了分析;其次在此基礎上,利用超高壓技術誘導IFTase構象發(fā)生變化,調(diào)控IFTase酶活、熱穩(wěn)定性等相關酶學性質(zhì),并探討構效關系。主要研究內(nèi)容和結果如下:(1)利用坐滴法制備了IFTase晶體。最終篩選得到的晶體生長條件為:0.2 mol/L一水合硫酸鋰,Tris-HCl緩沖液(0.1 M,p H 8.5),聚乙烯乙二醇3350(25%,w/v)。晶體大小為0.4×0.3×0.2 mm。衍射最終分辨率為2.15?。IFTase每個不對稱單元中含有三個基本相同的單體分子,并組成了一個三聚體。此三聚體通過每個亞基上Ser 293以及Ser 269之間兩兩形成的分子間氫鍵而穩(wěn)定。IFTase單體呈錐形,主要是由β-折疊所構成。和已報道的IFTase結構不同的是,每個IFTase分子有三處位置可以和7個底物分子GF4相結合。其中,Asp 169以及Gln 216可能是GF4分子中葡萄糖單元的結合位點或者識別位點。Trp 103上苯環(huán)和另一個亞基上Pro 133之間形成了π-σ共軛鍵,以穩(wěn)定IFTase分子及活性口袋。將IFTase中半胱氨酸突變成丙氨酸后,檢測其在80℃下熱穩(wěn)定性,實驗發(fā)現(xiàn)Cys 144、Cys 205、Cys 208對于IFTase熱穩(wěn)定性影響更為顯著。(2)利用超高壓技術處理IFTase酶溶液,對其構象及催化功能變化進行研究。IFTase經(jīng)不同強度壓力處理后發(fā)現(xiàn),在最適溫度60℃,200 MPa下處理15 min后,IFTase酶活略微升高13.6%。而隨著處理壓力強度提升,IFTase酶活逐漸降低。當處理壓力為600MPa時,殘余酶活僅為4.56%。此時,如果添加3 mol/L山梨糖醇能夠使IFTase酶活提高3.88倍,此實驗結果表明高濃度山梨糖醇能夠提高IFTase在高壓下的穩(wěn)定性。卸壓后,經(jīng)低壓處理后IFTase酶活具有回復性,而較高壓力處理后IFTase失活不可逆。另外,在200 MPa下IFTase熱穩(wěn)定性顯著提高。在80℃,在常壓下保溫25 min后,酶活僅剩余50.5%,而在200 MPa,80℃保溫25 min后,酶活還能保留約70%,IFTase熱失活速率常數(shù)可以降低55.9%,而失活活化能能提高1.41倍。采用圓二色譜、內(nèi)源熒光光譜、熒光探針技術、分子篩、電泳、動態(tài)光散射、原子力顯微鏡等方法考察經(jīng)不同壓力處理后,IFTase構象的變化。研究發(fā)現(xiàn),IFTase一級結構并沒有發(fā)生明顯的變化,而二級結構逐漸遭到了破壞。色氨酸的微環(huán)境變化則較為復雜。當處理壓力小于200 MPa時,色氨酸微環(huán)境更趨向于疏水。此時,IFTase整體構象變化較少,某些局部區(qū)域如Loop環(huán)由于柔性較大,更易受到壓力的影響。Loop環(huán)構象的變化可能會導致IFTase酶活發(fā)生變化。在較低壓力下,Loop環(huán)可能更為致密有序,將進一步穩(wěn)定活性口袋。這種構象變化“有利效應”抵消了壓力導致的“不利效應”,從而造成酶活在低壓下略微增加。而當壓力進一步增大時,色氨酸和水分子更容易接觸,分子表面疏水性增大,并且此時,IFTase三聚體發(fā)生解離,平均粒徑下降,亞基之間的分子間氫鍵、不同亞基間Pro 133和Trp 103形成的π-σ共軛鍵發(fā)生斷裂。IFTase剛性結構遭到破壞,從而造成IFTase在高壓下穩(wěn)定性降低,酶活喪失。而當添加山梨糖醇時,可能由于其能提供較多的氫鍵,從而穩(wěn)定了蛋白構象。壓力處理和溫度處理對其構象作用機制有所不同。經(jīng)200 MPa壓力處理15 min后,IFTase中分子內(nèi)二硫鍵含量增加。二硫鍵增多可以使IFTase熱穩(wěn)定性提高,但這并不是唯一因素。超高壓處理后,非共價鍵的變化也對改善酶熱穩(wěn)定性起了至關重要的作用。(3)在了解IFTase經(jīng)超高壓處理后其構象及酶學性質(zhì)變化的基礎上,利用超高壓技術考察IFTase催化水解菊糖反應體系,研究超高壓下IFTase催化熱動力學機制。研究發(fā)現(xiàn),IFTase最適催化條件為:反應壓力200 MPa,反應溫度60℃,此時米氏常數(shù)、活化能、活化焓、活化體積最低,周轉數(shù)、催化效率最高。在200 MPa下,IFTase最適反應p H為6.0,比常壓下提高0.5個單位。1.5 mol/L的Na Cl能進一步加快IFTase在高壓下的催化速度,而1.5 mol/L的Na NO3卻起著相反的效果。
【關鍵詞】：菊糖果糖轉移酶 晶體結構 超高壓 構象變化 催化行為
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TS201.25
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 緒論11-27
• 1.1 引言11
• 1.2 菊糖果糖轉移酶概述11-15
• 1.2.1 菊糖果糖轉移酶微生物來源及性質(zhì)11-13
• 1.2.2 菊糖果糖轉移酶結構及催化機制13-15
• 1.3 調(diào)控酶活性的物理化學以及生物學方法15
• 1.4 超高壓生物技術研究進展15-17
• 1.4.1 超高壓生物技術概念、特點及其發(fā)展15-16
• 1.4.2 超高壓生物技術應用16-17
• 1.5 超高壓對酶影響及其可能作用機制17-21
• 1.5.1 超高壓對酶催化能力影響17-19
• 1.5.2 超高壓對酶熱穩(wěn)定性影響19
• 1.5.3 超高壓對酶構象影響19-20
• 1.5.4 超高壓作用酶分子機制20-21
• 1.6 酶結構研究方法21-25
• 1.6.1 結晶衍射法21-23
• 1.6.2 光譜技術23-24
• 1.6.3 分子動力學模擬24-25
• 1.7 本課題立題依據(jù)、研究意義及主要研究內(nèi)容25-27
• 1.7.1 立題依據(jù)和研究意義25
• 1.7.2 本論文研究內(nèi)容25-27
• 第二章 IFTase晶體結構27-43
• 2.1 引言27
• 2.2 材料與方法27-30
• 2.2.1 主要試劑27
• 2.2.2 主要儀器27
• 2.2.3 IFTase制備及分離純化27-28
• 2.2.4 蛋白純度鑒定28
• 2.2.5 蛋白濃度確定28-29
• 2.2.6 酶活測定29
• 2.2.7 結晶方法29
• 2.2.8 X-衍射晶體數(shù)據(jù)收集及結構解析與模型修正29
• 2.2.9 定點突變29-30
• 2.2.10 IFTase及突變體熱穩(wěn)定性檢測30
• 2.2.11 數(shù)據(jù)處理30
• 2.3 結果與討論30-41
• 2.3.1 IFTase制備與分離純化30-31
• 2.3.2 結晶條件篩選以及衍射數(shù)據(jù)收集31-33
• 2.3.3 IFTase及IFTase-GF4復合物結構分析33-37
• 2.3.4 討論37-41
• 2.4 本章小結41-43
• 第三章 超高壓下IFTase的活性和構象43-62
• 3.1 引言43
• 3.2 材料與方法43-47
• 3.2.1 主要試劑43-44
• 3.2.2 主要儀器44
• 3.2.3 超高壓處理IFTase溶液44
• 3.2.4 不同溫度處理IFTase溶液44
• 3.2.5 鹽酸胍處理IFTase溶液44
• 3.2.6 酶活測定44
• 3.2.7 SDS-PAGE44
• 3.2.8 圓二色譜（CD）44-45
• 3.2.9 內(nèi)源熒光45
• 3.2.10 表面疏水性45
• 3.2.11 體積排阻色譜45-46
• 3.2.12 粒徑分析46
• 3.2.13 原子力顯微鏡（AFM）46
• 3.2.14 LC-MS46
• 3.2.15 分子動力學模擬46-47
• 3.2.16 數(shù)據(jù)處理47
• 3.3 結果與討論47-61
• 3.3.1 超高壓處理對IFTase酶活影響47-49
• 3.3.2 超高壓處理對IFTase構象影響49-58
• 3.3.3 壓力處理、溫度處理、變性劑處理后IFTase構象比較58-61
• 3.4 本章小結61-62
• 第四章 山梨糖醇對IFTase高壓穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)62-69
• 4.1 引言62
• 4.2 材料與方法62-63
• 4.2.1 主要試劑62
• 4.2.2 主要儀器62
• 4.2.3 IFTase-糖/糖醇復合物制備62-63
• 4.2.4 超高壓處理方法63
• 4.2.5 酶活測定63
• 4.2.6 粘度測定63
• 4.2.7 水分活度確定63
• 4.2.8 圓二色譜63
• 4.2.9 內(nèi)源熒光63
• 4.2.10 紫外吸收光譜63
• 4.2.11 數(shù)據(jù)處理63
• 4.3 結果與討論63-68
• 4.3.1 不同種類糖及濃度對IFTase壓力穩(wěn)定性影響63-64
• 4.3.2 山梨糖醇對IFTase構象穩(wěn)定作用64-66
• 4.3.3 可能機制分析66-68
• 4.4 本章小結68-69
• 第五章 超高壓下IFTase的熱穩(wěn)定性69-79
• 5.1 引言69
• 5.2 材料與方法69-71
• 5.2.1 主要試劑69
• 5.2.2 主要儀器69-70
• 5.2.3 高壓高溫處理IFTase70
• 5.2.4 超高壓下熱失活及熱失活動力學70
• 5.2.5 IFTase酶活測定70
• 5.2.6 圓二色譜70
• 5.2.7 內(nèi)源熒光70
• 5.2.8 原子力顯微鏡70
• 5.2.9 體積排阻色譜70
• 5.2.10 二硫鍵含量測定70-71
• 5.2.11 SDS-PAGE71
• 5.2.12 β-巰基乙醇對IFTase影響71
• 5.2.13 數(shù)據(jù)處理71
• 5.3 結果與討論71-78
• 5.3.1 超高壓提高IFTase熱穩(wěn)定性作用71-73
• 5.3.2 超高壓處理后IFTase構象分析73-76
• 5.3.3 討論：分子機制76-78
• 5.4 本章小結78-79
• 第六章 超高壓下IFTase的催化反應79-90
• 6.1 引言79
• 6.2 材料與方法79-81
• 6.2.1 主要試劑79
• 6.2.2 主要儀器79
• 6.2.3 壓力對IFTase催化反應影響79
• 6.2.4 超高壓下IFTase最適反應溫度的確定79-80
• 6.2.5 超高壓下IFTase最適反應pH的確定80
• 6.2.6 超高壓下金屬離子對IFTase催化反應的影響80
• 6.2.7 在超高壓下無機鹽對IFTase催化反應的影響80
• 6.2.8 超高壓下IFTase催化動力學及熱動力學參數(shù)計算80-81
• 6.2.9 DFAIII含量的確定及催化反應速度的計算81
• 6.2.10 數(shù)據(jù)處理81
• 6.3 結果與討論81-89
• 6.3.1 超高壓下對IFTase催化反應速度的影響81-82
• 6.3.2 超高壓下IFTase催化反應最適溫度的變化82-83
• 6.3.3 超高壓下IFTase催化反應最適pH的變化83
• 6.3.4 超高壓下金屬離子對IFTase催化反應的影響83-84
• 6.3.5 超高壓下無機鹽對IFTase催化反應的影響84-85
• 6.3.6 在超高壓下IFTase催化反應熱動力學參數(shù)變化85-89
• 6.4 本章小結89-90
• 主要結論與展望90-92
• 主要結論90
• 展望90-92
• 論文創(chuàng)新點92-93
• 致謝93-94
• 參考文獻94-103
• 附錄：作者在攻讀博士學位期間發(fā)表的論文103

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：1025958