發(fā)布時(shí)間：2017-10-13 12:25

  本文關(guān)鍵詞：黑蕓豆凝集素的純化和生物信息學(xué)及結(jié)構(gòu)與功能特性研究

  更多相關(guān)文章： 黑蕓豆 凝集素 分離純化 生物信息學(xué)分析 結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系 生物學(xué)活性

【摘要】：凝集素是一類具有重要生物活性的糖蛋白,可用于血型鑒定、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、惡性腫瘤細(xì)胞抑制、免疫應(yīng)答和藥物靶向定位的研究中,同時(shí),凝集素也是食品中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。凝聚素主要存在于豆類中,黑蕓豆是種植量較大的蕓豆品種之一,研究發(fā)現(xiàn)黑蕓豆中凝聚素的含量較高,但對(duì)黑蕓豆凝集素的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)性質(zhì)的認(rèn)識(shí)非常有限。本文對(duì)黑蕓豆凝集素的分離純化、凝集素的結(jié)構(gòu)、凝集素的理化性質(zhì)及生物學(xué)特性與凝集素結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)性研究,可為豆類凝集素功能性開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。本研究采用反膠束萃取方法對(duì)蕓豆水溶性蛋白粗提取物中的凝集素進(jìn)行了分離純化,并研究了反膠束萃取方法對(duì)凝集素活性和結(jié)構(gòu)的影響。確定反膠束萃取凝集素的工藝參數(shù)為:前萃取水相Na Cl濃度為77.6 mmol/L,p H值為5.7,AOT(二(2-乙基已基)丁二酸酯磺酸鈉)濃度為127.4 mmol/L;后萃取水相KCl濃度為593.0 mmol/L,p H值為8.0;在最佳工藝條件下,凝集素的得率為63.2±2.4 mg蛋白/g豆,純化倍數(shù)為8.8±0.2倍。反膠束萃取法對(duì)凝集素的活性沒(méi)有影響;經(jīng)傅立葉變換紅外光譜和圓二色光譜分析可知,反膠束萃取對(duì)凝集素蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著的影響。反膠束法萃取的凝集素樣品經(jīng)色譜純化后純度可達(dá)到94%以上,比傳統(tǒng)的離子交換和分子篩純化方法的蛋白得率提高了70%。基于LC-MS/MS方法,確定反膠束萃取分離純化的蛋白為凝集素,與PHA-E蛋白具有高度同源性。以黑蕓豆基因組DNA為模板,依據(jù)PHA-E蛋白c DNA序列合成的特異引物進(jìn)行同源克隆,獲得黑蕓豆凝集素蛋白的編碼基因序列。根據(jù)同源分析和進(jìn)化分析可知,黑蕓豆凝集素高度保守,可能與PHA-E蛋白共同分化自Arc7變種。根據(jù)對(duì)黑蕓豆凝集素的生物信息學(xué)分析,黑蕓豆凝集素為親水蛋白,具有較高的穩(wěn)定性,含有疏水內(nèi)核區(qū);在生理p H值下黑蕓豆凝集素可能以四聚體形式存在,含有高度保守的Lectin_leg B功能結(jié)構(gòu)域;蛋白分子中含有Ca2+和Mn2+結(jié)合位點(diǎn)及可能與N端糖基特異性結(jié)合的位點(diǎn);研究表明黑蕓豆凝集素含有B淋巴細(xì)胞抗原表位和T淋巴細(xì)胞抗原表位,具有潛在的抗癌細(xì)胞活性。黑蕓豆凝集素單體分子量為31 k Da,四聚體分子量約為116.97 k Da;黑蕓豆凝集素單體的等電點(diǎn)在5.27左右,二聚體等電點(diǎn)在6.03左右,四聚體等電點(diǎn)在6.91左右。利用熒光光譜法證明黑蕓豆凝集素蛋白可與N-乙酰-D-葡萄糖胺發(fā)生特異性結(jié)合,親和常數(shù)約為0.45 mmol/L,為中等強(qiáng)度的親和作用�；谀鼗钚曰謴�(fù)的方法,證明黑豆凝集素為金屬離子依賴性蛋白,Mn2+和Ca2+是黑蕓豆凝集素蛋白的必需金屬離子。對(duì)黑蕓豆凝集素?zé)崾Щ钆c蛋白構(gòu)象之間的關(guān)系進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)加熱導(dǎo)致凝集素蛋白折疊結(jié)構(gòu)的打開(kāi),使凝集素發(fā)生變性,凝集素的熱變性程度與加熱溫度和時(shí)間呈函數(shù)關(guān)系,其熱穩(wěn)定性符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。采用紫外、熒光光譜和DSC法對(duì)黑蕓豆凝集素的酸堿穩(wěn)定性進(jìn)行研究,結(jié)果表明在p H 2.0~10.0范圍內(nèi)凝集素具有相對(duì)穩(wěn)定的蛋白構(gòu)象。采用指數(shù)數(shù)學(xué)模型分析電泳條帶光密度變化,建立了較為準(zhǔn)確的體外模擬胃腸道消化評(píng)價(jià)體系,研究結(jié)果表明:黑蕓豆凝集素在模擬胃液和胰蛋白酶消化環(huán)境下穩(wěn)定性較好,半衰期分別為23 min和大于90 min;加熱和去離子化處理改變了凝集素的蛋白構(gòu)象,使得凝集素在模擬胃腸道環(huán)境下的消化性提高。MTT實(shí)驗(yàn)研究證明,在2 h內(nèi)黑蕓豆凝集素對(duì)腸道模擬上皮細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。致敏實(shí)驗(yàn)證明低劑量黑蕓豆凝集素(6 mg/120 g大鼠)未誘發(fā)動(dòng)物模型的致敏癥狀,黑蕓豆凝集素可同時(shí)促進(jìn)IL-4和INF-γ細(xì)胞因子的分泌,兩者的拮抗作用可能導(dǎo)致Ig E抗體的表達(dá)未達(dá)到陽(yáng)性癥狀水平,研究結(jié)果證明低劑量黑蕓豆凝集素蛋白不具有致敏性。初步研究了黑蕓豆凝集素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制作用,黑蕓豆凝集素的IC50值為9.85μg/m L,凝集素對(duì)Hela細(xì)胞的抑制能力與作用劑量和時(shí)間呈正相關(guān),高劑量的凝集素可使Hela細(xì)胞凋亡或壞死;當(dāng)凝集素濃度低于IC50值時(shí),Hela細(xì)胞以凋亡為主,當(dāng)凝集素濃度高于IC50值時(shí),Hela細(xì)胞以晚期凋亡和死亡為主;此外,黑蕓豆凝集素能顯著地影響Hela細(xì)胞周期分布,阻止Hela細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期,并對(duì)G2/M期也有一定的阻滯作用。
【關(guān)鍵詞】：黑蕓豆 凝集素 分離純化 生物信息學(xué)分析 結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系 生物學(xué)活性
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TS214.9;TQ460.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-17
• 第1章 緒論17-38
• 1.1 課題背景及研究的目的和意義17-19
• 1.2 凝集素學(xué)的研究進(jìn)展19-28
• 1.2.1 凝集素的定義和分類19-20
• 1.2.2 凝集素的分布20-21
• 1.2.3 凝集素的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)21-23
• 1.2.4 凝集素的生物功能特性23-25
• 1.2.5 凝集素的應(yīng)用25-28
• 1.3 蕓豆凝集素的研究進(jìn)展28-36
• 1.3.1 蕓豆凝集素的分離純化28-31
• 1.3.2 蕓豆凝集素的蛋白結(jié)構(gòu)研究31-33
• 1.3.3 蕓豆凝集素的理化性質(zhì)研究33-34
• 1.3.4 蕓豆凝集素的生物安全性和活性研究34-36
• 1.4 本論文的主要研究?jī)?nèi)容36-38
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法38-59
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備38-40
• 2.1.1 主要原料38
• 2.1.2 主要試劑38-39
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備39-40
• 2.2 測(cè)定方法40-48
• 2.2.1 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定40
• 2.2.2 凝血活性測(cè)定40-42
• 2.2.3 反膠束水分含量的測(cè)定42
• 2.2.4 凝膠電泳分析42
• 2.2.5 反向高效液相色譜分析42-43
• 2.2.6 傅立葉變換紅外光譜分析43
• 2.2.7 圓二色光譜分析43
• 2.2.8 串聯(lián)質(zhì)譜分析43-44
• 2.2.9 高效凝膠排阻色譜分析44
• 2.2.10 全柱成像等電聚焦毛細(xì)管電泳儀分析44
• 2.2.11 熒光光譜分析44
• 2.2.12 紫外光譜分析44
• 2.2.13 差示掃描量熱分析44-45
• 2.2.14 主動(dòng)全身過(guò)敏實(shí)驗(yàn)45
• 2.2.15 被動(dòng)皮膚過(guò)敏實(shí)驗(yàn)45
• 2.2.16 大鼠免疫血清中Ig E抗體的測(cè)定45-46
• 2.2.17 大鼠免疫血漿中組胺的測(cè)定46
• 2.2.18 大鼠免疫血清中細(xì)胞因子的測(cè)定46-47
• 2.2.19 MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性測(cè)定47
• 2.2.20 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察47
• 2.2.21 細(xì)胞的凋亡與壞死測(cè)定47-48
• 2.2.22 細(xì)胞周期的測(cè)定48
• 2.3 論文前期研究進(jìn)展及研究對(duì)象選擇48-49
• 2.4 反膠束分離純化黑蕓豆凝集素的實(shí)驗(yàn)49-52
• 2.4.1 蕓豆水溶性蛋白的提取工藝實(shí)驗(yàn)49
• 2.4.2 黑蕓豆凝集素的反膠束萃取實(shí)驗(yàn)49-51
• 2.4.3 反膠束萃取對(duì)黑蕓豆凝集素蛋白結(jié)構(gòu)影響的實(shí)驗(yàn)51-52
• 2.5 黑蕓豆凝集素的蛋白鑒定及生物信息學(xué)分析實(shí)驗(yàn)52-54
• 2.5.1 黑蕓豆凝集素蛋白的鑒定及基因克隆52-53
• 2.5.2 黑蕓豆凝集素的蛋白序列分析53
• 2.5.3 黑蕓豆凝集素蛋白的生物信息學(xué)分析53-54
• 2.6 黑蕓豆凝集素的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)關(guān)系研究實(shí)驗(yàn)54-56
• 2.6.1 黑蕓豆凝集素的基本物理特性54
• 2.6.2 黑蕓豆凝集素的親和特性研究實(shí)驗(yàn)54-55
• 2.6.3 黑蕓豆凝集素的熱失活與蛋白構(gòu)象之間的關(guān)系實(shí)驗(yàn)55
• 2.6.4 黑蕓豆凝集素酸堿穩(wěn)定性與蛋白構(gòu)象之間的關(guān)系實(shí)驗(yàn)55-56
• 2.7 黑蕓豆凝集素的生物安全性和抑制Hela細(xì)胞增殖作用實(shí)驗(yàn)56-58
• 2.7.1 黑蕓豆凝集素的體外消化實(shí)驗(yàn)56
• 2.7.2 黑蕓豆凝集素的免疫致敏性研究實(shí)驗(yàn)56-57
• 2.7.3 黑蕓豆凝集素抗人宮頸癌細(xì)胞活性的初步研究實(shí)驗(yàn)57-58
• 2.8 數(shù)據(jù)處理58-59
• 第3章 反膠束分離純化黑蕓豆凝集素的研究59-94
• 3.1 引言59-60
• 3.2 蕓豆水溶性蛋白的提取工藝研究60-65
• 3.2.1 蕓豆粉碎方式的確定60-62
• 3.2.2 浸提溶劑的選擇62-63
• 3.2.3 料液比的確定63-64
• 3.2.4 浸提時(shí)間的確定64-65
• 3.3 黑蕓豆凝集素的前萃取工藝參數(shù)研究65-73
• 3.3.1 前萃取水分含量的確定66-68
• 3.3.2 前萃取離子強(qiáng)度的確定68-69
• 3.3.3 前萃取p H值的確定69-71
• 3.3.4 前萃取表面活性劑濃度的確定71-72
• 3.3.5 前萃取時(shí)間的確定72-73
• 3.4 黑蕓豆凝集素的后萃取工藝參數(shù)研究73-78
• 3.4.1 后萃取p H值的確定73-74
• 3.4.2 后萃取離子強(qiáng)度的確定74-76
• 3.4.3 反膠束萃取黑蕓豆凝集素的得率和純度76-78
• 3.5 反膠束萃取黑蕓豆凝集素的優(yōu)化設(shè)計(jì)78-86
• 3.5.1 反膠束萃取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及模型擬合78-81
• 3.5.2 反膠束萃取各因素的交互作用影響81-84
• 3.5.3 反膠束萃取的最佳參數(shù)及驗(yàn)證84-86
• 3.6 反膠束萃取對(duì)黑蕓豆凝集素蛋白結(jié)構(gòu)的影響86-92
• 3.6.1 黑蕓豆凝集素蛋白的進(jìn)一步純化86-89
• 3.6.2 黑蕓豆凝集素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析89-92
• 3.7 本章小結(jié)92-94
• 第4章 黑蕓豆凝集素的蛋白鑒定及生物信息學(xué)分析94-123
• 4.1 引言94-95
• 4.2 黑蕓豆凝集素蛋白的鑒定及基因克隆95-100
• 4.2.1 電噴霧四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定凝集素蛋白95-98
• 4.2.2 黑蕓豆凝集素的基因克隆98-100
• 4.3 黑蕓豆凝集素的蛋白序列分析100-103
• 4.3.1 黑蕓豆凝集素蛋白序列的同源性分析100-102
• 4.3.2 黑蕓豆凝集素蛋白序列的進(jìn)化分析102-103
• 4.4 黑蕓豆凝集素蛋白的生物信息學(xué)分析103-122
• 4.4.1 黑蕓豆凝集素蛋白的基本性質(zhì)分析103-110
• 4.4.2 黑蕓豆凝集素蛋白的結(jié)構(gòu)域分析110-112
• 4.4.3 黑蕓豆凝集素蛋白的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)112-119
• 4.4.4 黑蕓豆凝集素蛋白的抗原表位預(yù)測(cè)119-122
• 4.5 本章小結(jié)122-123
• 第5章 黑蕓豆凝集素蛋白的構(gòu)效關(guān)系研究123-152
• 5.1 引言123-124
• 5.2 黑蕓豆凝集素的基本物理特性124-129
• 5.2.1 黑蕓豆凝集素的蛋白分子量124-127
• 5.2.2 黑蕓豆凝集素的蛋白等電點(diǎn)127-129
• 5.3 黑蕓豆凝集素的親和特性研究129-135
• 5.3.1 黑蕓豆凝集素的糖專一性及糖蛋白功能性分析129-134
• 5.3.2 黑蕓豆凝集素的金屬離子依賴性及蛋白構(gòu)象分析134-135
• 5.4 黑蕓豆凝集素的熱失活與蛋白構(gòu)象之間的關(guān)系135-142
• 5.4.1 熱處理對(duì)黑蕓豆凝集素活性及結(jié)構(gòu)的影響136-139
• 5.4.2 黑蕓豆凝集素?zé)崾Щ顒?dòng)力學(xué)分析139-142
• 5.5 黑蕓豆凝集素酸堿穩(wěn)定性與蛋白構(gòu)象之間的關(guān)系142-150
• 5.5.1 紫外光譜分析142-144
• 5.5.2 熒光光譜分析144-148
• 5.5.3 DSC分析148-150
• 5.6 本章小結(jié)150-152
• 第6章 黑蕓豆凝集素的生物安全性和抑制Hela細(xì)胞增殖作用152-178
• 6.1 引言152-153
• 6.2 黑蕓豆凝集素的體外消化性153-161
• 6.2.1 黑蕓豆凝集素的體外消化穩(wěn)定性154-156
• 6.2.2 熱處理黑蕓豆凝集素的體外消化穩(wěn)定性156-158
• 6.2.3 去離子化黑蕓豆凝集素的體外消化穩(wěn)定性158-161
• 6.3 黑蕓豆凝集素的致敏性161-169
• 6.3.1 黑蕓豆凝集素對(duì)模擬腸道上皮細(xì)胞的毒性161-163
• 6.3.2 過(guò)敏模型建立及主動(dòng)全身過(guò)敏癥狀163-164
• 6.3.3 被動(dòng)皮膚過(guò)敏實(shí)驗(yàn)164-166
• 6.3.4 大鼠血清中的Ig E抗體水平166-167
• 6.3.5 大鼠血漿中的組胺水平167-168
• 6.3.6 黑蕓豆凝集素對(duì)細(xì)胞因子水平的影響168-169
• 6.4 黑蕓豆凝集素抗人宮頸癌細(xì)胞活性的初步研究169-176
• 6.4.1 黑蕓豆凝集素對(duì)Hela細(xì)胞的體外增殖抑制作用169-171
• 6.4.2 黑蕓豆凝集素對(duì)Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響171-172
• 6.4.3 黑蕓豆凝集素誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡/壞死作用172-174
• 6.4.4 黑蕓豆凝集素對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響174-176
• 6.5 本章小結(jié)176-178
• 結(jié)論178-180
• 創(chuàng)新點(diǎn)180
• 展望180-181
• 參考文獻(xiàn)181-200
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文及其它成果200-203
• 致謝203-204
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷204

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