【摘要】 第一部分Real-time qPCR檢測大鼠Sombati難治性癲癇細(xì)胞模型中Integrin β1基因表達(dá)變化目的：整合素-跨膜系統(tǒng)主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，本實驗初步探討在海馬神經(jīng)元的體外癲癇細(xì)胞模型中的細(xì)胞表面受體整合素β1（Integrin β1）在癲癇致癇性形成中的可能作用。方法：利用Neurobasal Medium無血清神經(jīng)培養(yǎng)基和B-27因子體外培養(yǎng)SD新生乳鼠的海馬神經(jīng)元，對培養(yǎng)至第14天的細(xì)胞，參照Sombati的方法制備體外難治性癲癇模型，隨機(jī)分為正常對照組（Control）、Sombati癲癇細(xì)胞模型組（低Mg2+），分別在用含有1mM Mg2+的pBRS液或低Mg2+的pBRS液培養(yǎng)細(xì)胞3h后，各組神經(jīng)元在恢復(fù)維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在之后的第4天，采用Real-time qPCR方法檢測Integrin β1的表達(dá)。結(jié)果：Sombati癲癇細(xì)胞造模后4天與正常海馬神經(jīng)細(xì)胞相比，Integrinβ1基因表達(dá)水平均明顯高于正常海馬神經(jīng)細(xì)胞。結(jié)論：Integrin β1基因在Sombati癲癇細(xì)胞模型中表達(dá)增高，可能參與了難治性癲癇的形成過程。第二部分Integrin β1shRNA重組慢病毒載體的構(gòu)建及其對Sombati難治性癲癇細(xì)胞Integrin β1基因表達(dá)的影響目的：構(gòu)建Integrin β1基因RNA干擾慢病毒載體，為研究Sombati癲癇細(xì)胞模型Integrin β1的作用機(jī)制提供載體。方法:（1）針對Integrin β1目的基因序列，利用的RNA干擾序列設(shè)計軟件，設(shè)計4個針對Integrin β1的RNA干擾靶點序列，構(gòu)建4個shRNA慢病毒重組質(zhì)粒，測序鑒定陽性克隆，常規(guī)培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，將慢病毒shRNA載體及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝、濃縮、滴度測定，并收集病毒。（2）常規(guī)培養(yǎng)PC12細(xì)胞，將構(gòu)建的Integrin β1shRNA1-4轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，分為Integrin β1shRNANC組、Integrin β1shRNA1組、 Integrin β1shRNA2組、Integrin β1shRNA3組和Integrin shRNA4組，在倒置熒光顯微鏡下觀察，估算慢病毒感染PC12細(xì)胞的效率，并采用Western blotting檢測Integrin β1shRNA系統(tǒng)在PC12靶細(xì)胞中的沉默效果，以篩選出沉默效果最好的其中一條Integrin β1shRNA慢病毒載體。（3）常規(guī)培養(yǎng)至第11天的海馬神經(jīng)元，分別轉(zhuǎn)染Integrin β1shRNA NC和篩選出來的沉默效果最好的Integrin β1shRNA2慢病毒，繼續(xù)培養(yǎng)至第14天，參照Sombati方法制備體外難治性癲癇模型的方法，將已經(jīng)轉(zhuǎn)染Integrin β1shRNANC的細(xì)胞，用低Mg2+的pBRS液或者含有1mMMg2+的pBRS液分別培養(yǎng)細(xì)胞3h，同時將已經(jīng)轉(zhuǎn)染Integrin β1shRNA2慢病毒的細(xì)胞，用低Mg2+的pBRS液或者含有1mM Mg2+的pBRS液分別培養(yǎng)細(xì)胞3h，具體分組如下：正常海馬神經(jīng)元+Integrin β1shRNA NC、正常海馬神經(jīng)元+Integrin β1shRNA2、Sombati癲癇細(xì)胞模型組+Integrin β1shRNANC，Sombati癲癇細(xì)胞模型組+Integrin β1shRNA2，各組神經(jīng)元均恢復(fù)維持培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，通過Western blotting檢測其對海馬神經(jīng)元和Sombati癲癇細(xì)胞Integrin β1的基因沉默效果。結(jié)果：經(jīng)測序證實RNAi慢病毒載體構(gòu)建成功，病毒達(dá)到有效滴度；Western blotting證實，重組慢病毒Integrin β1shRNA2感染海馬神經(jīng)元和Sombati癲癇細(xì)胞后Integrin β1蛋白表達(dá)顯著下降。結(jié)論：成功構(gòu)建Integrin β1RNA干擾慢病毒載體，并在新生大鼠海馬神經(jīng)元和Sombati癲癇細(xì)胞中實現(xiàn)有效的基因沉默效應(yīng)。第三部分Integrin β1沉默后Sombati難治性癲癇細(xì)胞模型的FAK依賴相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)變化目的：利用Integrin β1慢病毒載體轉(zhuǎn)染Sombati癲癇細(xì)胞模型，探討Integrin β1相關(guān)信號通路在致癲癇中的作用及其機(jī)制，為進(jìn)一步闡明癲癇的發(fā)病機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。方法：利用Neurobasal Medium無血清神經(jīng)培養(yǎng)基和B-27因子體外培養(yǎng)SD新生乳鼠的海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為以下四組：正常海馬神經(jīng)元、Sombati癲癇細(xì)胞模型、Sombati癲癇細(xì)胞模型+Integrin β1shRNA NC、Sombati癲癇細(xì)胞模型+Integrin β1shRNA2，培養(yǎng)至第11天時，用Integrin β1shRNA NC感染Sombati癲癇細(xì)胞模型+Integrin β1shRNA NC組的細(xì)胞，用Integrin β1shRNA2感染Sombati癲癇細(xì)胞模型+Integrin β1shRNA2組的細(xì)胞，至培養(yǎng)第14天時，參照Sombati的方法制備體外難治性癲癇模型，對Sombati癲癇細(xì)胞模型組、Sombati癲癇細(xì)胞模型+Integrin β1shRNA NC組、Sombati癲癇細(xì)胞模型+Integrin β1shRNA2組用低Mg2+的pBRS液培養(yǎng)細(xì)胞3h，恢復(fù)維持培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)4天，正常海馬神經(jīng)元組則用含有1mM Mg2+的pBRS液培養(yǎng)細(xì)胞3h，恢復(fù)維持培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)4天，各組細(xì)胞均采用Western blotting檢測信號通路蛋白Phospho-FAK(Tyr397)、Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)、Phospho-PAK1（Ser199/204）/PAK3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與Sombati癲癇細(xì)胞+Integrinβ1shRNA2組相比，正常海馬神經(jīng)元、Sombati癲癇細(xì)胞和Sombati癲癇細(xì)胞+Integrin β1RNA NC的Phospho-FAK水平表達(dá)升高（P<0.01）；與正常海馬神經(jīng)元相比，Sombati癲癇細(xì)胞和Sombati癲癇細(xì)胞+Integrin β1RNA NC的Phospho-FAK水平表達(dá)升高（P<0.01），Sombati癲癇細(xì)胞和Sombati癲癇細(xì)胞+Integrin β1RNA NC組的Phospho-FAK水平無明顯差異；在正常原代海馬神經(jīng)元、Sombati癲癇細(xì)胞模型以及轉(zhuǎn)染了Integrin β1shRNA NC、Integrin β1shRNA2的Sombati癲癇細(xì)胞中，各組細(xì)胞的Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)、Phospho-PAK1(Ser199/204)/PAK3蛋白表達(dá)水平無明顯變化。結(jié)論：Integrin β1在Sombati癲癇細(xì)胞中發(fā)揮作用依賴于FAK相關(guān)通路的激活，主要是啟動了Tyr397磷酸化位點，但與Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)和Phospho-PAK1（Ser199/204）/PAK3蛋白的激活無關(guān)。 

前 言  

目前，癲癇的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，受到研究者們普遍關(guān)注的是離子通道學(xué)說和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說認(rèn)為，反復(fù)發(fā)作的易感性的存在是癲癇最為突出的病理生理特征。借助倒置熒光顯微鏡和雙光子激發(fā)熒光成像技術(shù)觀察電刺激下的轉(zhuǎn)基因鼠的杏仁核，其神經(jīng)突觸末端可以與下位或者鄰位神經(jīng)元形成新的突觸聯(lián)系，隨著癲癇的反復(fù)發(fā)作，這些初期可逆性突觸異常連接逐漸成為固定的新連接，病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其主要成分為苔蘚纖維的芽生（Mossy fiber sprout，MFS），即與神經(jīng)元樹突形成新的軸突聯(lián)系，引起異常興奮性環(huán)路重建[3]。已有研究表明，癲癇的反復(fù)放電造成神經(jīng)突起異常生長，生長錐結(jié)構(gòu)改變，軸突改向，突觸重構(gòu)，最終形成異常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，其中的生長錐的異常生長和突觸重構(gòu)在難治性癲癇的難治性形成中起著關(guān)鍵的作用[4,5]。
因此，從整合素分子水平來研究突觸重構(gòu)和異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用將具有重要意義。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，將按照Sombati[16-19]等方法制備癲癇細(xì)胞模型，采用Real-time qPCR 方法檢測體外Sombati 癲癇細(xì)胞模型中的重要的神經(jīng)元細(xì)胞表面受體整合素 β1（Integrin β1），探討內(nèi)源性Integrin β1對海馬神經(jīng)細(xì)胞生長的影響，探討其在癲癇致癇性形成過程中的作用及其分子調(diào)節(jié)機(jī)制；通過構(gòu)建慢病毒載體沉默內(nèi)源性 Integrin β1，采用 Real-time qPCR 、Western blotting觀察神經(jīng)細(xì)胞生理生化的變化及Integrin β1 介導(dǎo)的相關(guān)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化，進(jìn)一步完善整合素在癲癇致病中的分子機(jī)制研究。

................

第一部分  Real-time  qPCR 檢測大鼠 Sombati 癲癇細(xì)胞模型中 Integrin β1 基因表達(dá)變化 

1 材料和方法
熒光定量PCR儀 7500 Fast  ABI 公司
熒光顯微鏡  Olympus 公司
Olympus IX 51倒置顯微鏡  Olympus公司
SW-CJ-1F垂直單向流潔凈工作臺  蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司
細(xì)胞培養(yǎng)箱  Thermo公司 
電子精密天平BS2245  北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司
 臺式高速冷凍離心機(jī)3K-15  Sigma公司 
電熱恒溫干燥箱   上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠
 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40SII 上海申安醫(yī)療器械廠
 自動三重純水蒸餾器SZ-97  上海亞榮生化儀器械廠

2 結(jié) 果
整合素是按不同的組合構(gòu)成 24 種整合素，含β1 亞單位的整合素主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分之間的粘附[20]。研究認(rèn)為，Integrin β1 作為細(xì)胞重要的跨膜糖蛋白，廣泛表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，是重要的神經(jīng)元表面細(xì)胞受體，是連接細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架蛋白的重要分子結(jié)構(gòu)，可以與層粘連蛋白、纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分結(jié)合，參與細(xì)胞外環(huán)境信息交換，維持細(xì)胞骨架，影響神經(jīng)元極性，并介導(dǎo)神經(jīng)元的分化、遷移，參與神經(jīng)突觸的形成及突觸后介質(zhì)的成熟，在神經(jīng)生長發(fā)育過程中起重要作用[21-23]。它們不僅參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和可塑性，而且和成熟神經(jīng)元的病理狀態(tài)密切相關(guān)。

第二部分Integrin β1 shRNA 重組慢病毒載體的構(gòu)建及其對 Sombati癲癇細(xì)胞 Integrin β1基因表達(dá)的影響 ............... 29
 材料與方法…………29 
結(jié)果…………………………47 
討論……………………………50 
第三部分  Integrin β1沉默后 Sombati癲癇細(xì)胞的FAK 依賴相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)變化55
55材料與方法……………………55
 結(jié)果............64
 討論………………………………65
 結(jié)論………………69

第三部分   Integrin β1沉默后 Sombati癲癇細(xì)胞的FAK 依賴相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)變化

1 材料與方法
在第一部分中，我們實驗結(jié)果提示在 Sombati 癲癇細(xì)胞中的 Integrin β1 異常高表達(dá)可能與癲癇的形成和發(fā)展相關(guān)，然而，其細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚未十分清楚。Integrin β1 的主要生物學(xué)作用是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與外基質(zhì)之間的相互粘附，其作為跨膜接頭在細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白骨架之間起雙向的聯(lián)絡(luò)作用，目前研究認(rèn)為，Integrin β1 主要通過激活兩種酪氨酸依賴性通道發(fā)揮作用，即粘附斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）和 SHc 通道，本部分實驗擬利用構(gòu)建的 Integrin β1 重組慢病毒載體，沉默 Sombati 癲癇細(xì)胞中的內(nèi)源性的 Integrin β1，對Integrin β1 在Sombati 癲癇細(xì)胞中的FAK 相關(guān)信號途徑進(jìn)行初步探討。

2 結(jié) 果
整合素是以α和β兩個亞基結(jié)合而形成的異二聚體糖蛋白，目前已經(jīng)至少發(fā)現(xiàn) 24 種亞型[53,54]。整合素的α和β兩種亞基都是Ⅰ型跨膜糖蛋白，它們在結(jié)構(gòu)上具有以下的共同特征：都有一個較長的胞外域、一個單次跨膜域和一個較短的無催化作用的胞內(nèi)域（β4 亞基除外）。整合素β亞基分子量基本分布在90000-110000Da之間，根據(jù)β亞基種類的不同，可分為8 個（β1-β8）不同的亞家族，其中的整合素β1 亞家族又稱為遲現(xiàn)抗原組（VLA）,β1(CD29)在體內(nèi)廣泛表達(dá)，β1 整合素亞單位可以與 CD49a-f（α1-α6）、CD51（αv）以及α7-α11 分別組成VLA-1 至 VLA-6、αvβ1（VNR-β1）、α7β1、α8β1、α9β1 和α11β1 整合素分子[55,56]。含β1 亞單位的整合素主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞成分之間的作用,與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)分子相互結(jié)合可以活化T 細(xì)胞，并調(diào)節(jié)CD 分子的活性,在整合素分子和配體結(jié)合過程中，最常見的識別序列是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列（Arg-Gly-Asp，RGD），即 RGD 序列,其可根據(jù)其識別的配體分子的不同，分為 3 大類，分別為：①識別 RGD 序列的整合素分子，包括α5β1、αvβ1；②識別非RGD 序列的整合素分子，包括α2β1、α4β1；③識別序列不明確的整合素分子，包括α1β1、α6β1、α7β1、α8β1 等[55]。

...........

結(jié)   論

1 結(jié)合我們前期的關(guān)于整合素研究成果，推測 Integrin β1 基因可能參與了難治性癲癇的形成過程，尤其是 Sombati 癲癇細(xì)胞持續(xù)自發(fā)性放電后的后期異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重組過程。3通過 5'-GGAGGATTACTTCAGACTTCC-3'構(gòu)建的慢病毒載體能在新生大鼠海馬神經(jīng)元和Sombati 癲癇細(xì)胞中實現(xiàn)有效的基因沉默效應(yīng)。Integrin β1 在 Sombati 癲癇細(xì)胞中發(fā)揮作用依賴于 FAK 相關(guān)通路的激活，主要是啟動了Tyr397磷酸化位點，但與Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)和Phospho-PAK1 (Ser199/204) / PAK3 蛋白的激活無關(guān)。

.................

參考文獻(xiàn)：

• [1] 魏勝程.  藥物難治性癲癇手術(shù)治療方式的選擇及療效觀察[D]. 山東大學(xué) 2012
• [2] 鐘愷.  低頻率電刺激海馬下托對大鼠顳葉癲癇及難治性癲癇的治療作用研究[D]. 浙江大學(xué) 2013
• [3] 陳陽美.  難治性癲癇發(fā)病機(jī)理與危險因素的探討[D]. 重慶醫(yī)科大學(xué) 2002
• [4] 吳朝暉.  立體定位腦電定位難治性癲癇致癇灶[D]. 第二軍醫(yī)大學(xué) 2010
• [5] 青浩渺.  FDG-PET腦顯像在藥物難治性癲癇外科治療臨床決策中的價值[D]. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 2012
• [6] 王強(qiáng).  寧癇顆粒聯(lián)合卡馬西平對難治性癲癇大鼠的相關(guān)性研究[D]. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 2013
• [7] 周盛年.  電刺激大鼠癲癇模型及基因芯片檢測谷胱苷肽-巰-轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)[D]. 山東大學(xué) 2004
• [8] 劉備.  乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用研究[D]. 第四軍醫(yī)大學(xué) 2013
• [9] 孔敏.  多藥耐藥基因及P-糖蛋白在預(yù)測兒童抗癲癇藥物療效中作用的研究[D]. 重慶醫(yī)科大學(xué) 2013
• [10] 馬愛梅.  PGP和MRP在難治性癲癇耐藥機(jī)制中作用的研究[D]. 復(fù)旦大學(xué) 2005