本文關(guān)鍵詞：利用工程大腸桿菌生物法合成香葉醇的發(fā)酵工藝研究

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【摘要】：香葉醇作為一種廣泛應(yīng)用于香精香料、日化、食品、藥物等領(lǐng)域的無環(huán)單萜烯醇,市場(chǎng)需求旺盛。目前植物提取和化學(xué)合成是香葉醇的兩種主要合成方法,然而這兩種合成方法存在許多問題,如成本高、污染環(huán)境、選擇性差等等,則以廉價(jià)、可再生的生物質(zhì)為原料生物法合成香葉醇成為了發(fā)展趨勢(shì)。本論文首先構(gòu)建了以葡萄糖為原料,生物法合成香葉醇的工程大腸桿菌；然后在搖瓶水平進(jìn)行發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化,提高香葉醇產(chǎn)量；最后放大到5L發(fā)酵罐水平獲得高產(chǎn)量的香葉醇,并對(duì)年產(chǎn)2500噸香葉醇的發(fā)酵生產(chǎn)工藝進(jìn)行了設(shè)計(jì)。論文的主要內(nèi)容和取得的主要結(jié)論包括以下幾個(gè)方面：(1)利用分子生物學(xué)技術(shù),通過在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)甲羥戊酸(MVA)生物合成途徑及香葉醇合成酶GES基因,構(gòu)建了以葡萄糖為原料,生物法合成香葉醇的代謝途徑：通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測(cè)確定發(fā)酵產(chǎn)物為香葉醇,并建立了香葉醇的氣相色譜(GC)定量檢測(cè)方法,得到其定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)搖瓶水平發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化：利用單因素的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化,優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：誘導(dǎo)時(shí)間為菌體的OD600nm值1.0左右,誘導(dǎo)劑IPTG濃度為1.0mM,誘導(dǎo)溫度為30℃,pH為6.0,轉(zhuǎn)速為180r/min,并將優(yōu)化條件用于培養(yǎng)基的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中。利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基：首先運(yùn)用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選培養(yǎng)基中影響香葉醇產(chǎn)量的關(guān)鍵因素：再運(yùn)用最陡爬坡法使關(guān)鍵因素的濃度接近最佳響應(yīng)區(qū)域；最后通過中心組合設(shè)計(jì)確定了關(guān)鍵因素的最佳濃度及回歸模型。結(jié)果表明,檸檬酸鐵銨、硫酸鎂和微量元素為影響香葉醇產(chǎn)量的關(guān)鍵因素,培養(yǎng)基中關(guān)鍵組分的最佳濃度為：檸檬酸鐵銨0.13g/L,硫酸鎂17.6mmol/L,微量元素16.7ml/L。優(yōu)化后香葉醇產(chǎn)量從最初的50.12mg/L提高到223.24mg/L,相比初始的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基產(chǎn)量提高到4.45倍。(3)5L發(fā)酵罐水平發(fā)酵工藝的探究：在5L發(fā)酵罐水平建立了香葉醇的發(fā)酵工藝。由于香葉醇具有抑菌性和揮發(fā)性,在發(fā)酵過程中采用雙相發(fā)酵,即發(fā)酵過程中添加萃取劑肉豆蔻酸異丙酯,實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵和分離的同時(shí)進(jìn)行,最終達(dá)到了香葉醇的穩(wěn)定生產(chǎn)。經(jīng)過48h的誘導(dǎo)培養(yǎng),菌體的OD600nm值為45左右,香葉醇濃度達(dá)到2g/L左右,收率為3.5%左右(理論收率28.5%)。(4)對(duì)于生物法合成香葉醇的工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)行了設(shè)計(jì),生產(chǎn)過程采用雙相發(fā)酵,設(shè)計(jì)目標(biāo)是年產(chǎn)2500噸香葉醇(純度≥90%),收率達(dá)到18%(理論收率28.5%),設(shè)計(jì)主要包括了工藝的設(shè)計(jì)與計(jì)算、主要設(shè)備的選型與計(jì)算和工藝流程圖的繪制。
【關(guān)鍵詞】：香葉醇 工程大腸桿菌 響應(yīng)面分析方法 優(yōu)化 設(shè)計(jì)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TQ929
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 0 引言12-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-28
• 1.1 生物法合成萜類化合物的研究進(jìn)展13-17
• 1.1.1 萜類化合物的簡(jiǎn)介13-14
• 1.1.2 生物法合成途徑14-16
• 1.1.3 生物法合成萜類化合物的研究進(jìn)展16-17
• 1.2 香葉醇介紹17-20
• 1.2.1 香葉醇的物理化學(xué)性質(zhì)簡(jiǎn)介17
• 1.2.2 香葉醇的用途17-18
• 1.2.3 香葉醇的合成方法及研究現(xiàn)狀18-20
• 1.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化概述20-26
• 1.3.1 培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵的影響20-22
• 1.3.2 培養(yǎng)條件對(duì)發(fā)酵的影響22-24
• 1.3.3 發(fā)酵優(yōu)化的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法24-26
• 1.4 本課題的主要研究?jī)?nèi)容和意義26-28
• 1.4.1 本課題的主要研究?jī)?nèi)容26-27
• 1.4.2 研究意義27-28
• 2 生物法合成香葉醇的初步探究實(shí)驗(yàn)28-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料29-32
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒29
• 2.1.2 主要試劑29-31
• 2.1.3 主要儀器31-32
• 2.1.4 培養(yǎng)基32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法32-37
• 2.2.1 工程大腸桿菌的構(gòu)建32-36
• 2.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的驗(yàn)證36
• 2.2.3 香葉醇檢測(cè)方法的建立36-37
• 2.3 結(jié)果與討論37-42
• 2.3.1 工程大腸桿菌的構(gòu)建37-39
• 2.3.2 發(fā)酵產(chǎn)物的驗(yàn)證39-40
• 2.3.3 香葉醇定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制40-42
• 2.4 本章小結(jié)42-43
• 3 搖瓶水平發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件的優(yōu)化43-59
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料43
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法43-45
• 3.2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化43-44
• 3.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化44-45
• 3.2.3 優(yōu)化條件和優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)香葉醇產(chǎn)量提高的檢驗(yàn)45
• 3.3 結(jié)果與討論45-58
• 3.3.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化45-50
• 3.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化50-57
• 3.3.3 優(yōu)化條件和優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)香葉醇產(chǎn)量提高的檢驗(yàn)57-58
• 3.4 本章小結(jié)58-59
• 4 5L發(fā)酵罐水平發(fā)酵工藝的探究59-66
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料59
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法59-61
• 4.2.1 常規(guī)發(fā)酵59-60
• 4.2.2 外源添加香葉醇標(biāo)品發(fā)酵60
• 4.2.3 雙相發(fā)酵60-61
• 4.3 結(jié)果與討論61-65
• 4.3.1 常規(guī)發(fā)酵61-62
• 4.3.2 外源添加香葉醇標(biāo)品發(fā)酵62-63
• 4.3.3 雙相發(fā)酵63-65
• 4.4 本章小結(jié)65-66
• 5 年產(chǎn)2500噸香葉醇的發(fā)酵生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)66-75
• 5.1 生產(chǎn)工藝流程的設(shè)計(jì)與計(jì)算66-69
• 5.1.1 生產(chǎn)工藝步驟與流程示意圖66-68
• 5.1.2 物料衡算68-69
• 5.2 主要設(shè)備的選型與計(jì)算69-74
• 5.2.1 發(fā)酵罐的選型與設(shè)計(jì)69-73
• 5.2.2 主要設(shè)備一覽表73-74
• 5.3 “三廢”排放及處理74-75
• 6 結(jié)論與展望75-77
• 6.1 結(jié)論75-76
• 6.2 展望76-77
• 參考文獻(xiàn)77-81
• 附錄81-82
• 致謝82-83
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷83
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文83

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本文編號(hào)：587554