本文關(guān)鍵詞：α-酮戊二酸工程菌構(gòu)建及發(fā)酵條件控制

  更多相關(guān)文章： 谷氨酸棒狀桿菌 α-酮戊二酸 L-谷氨酸 糖酸轉(zhuǎn)化率 敲除 生物素

【摘要】：α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)是微生物體內(nèi)的三羧酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物,它作為碳氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),在菌體的生長(zhǎng)代謝中發(fā)揮重要作用。在醫(yī)藥、食品、化妝品、工農(nóng)業(yè)及化工合成等領(lǐng)域中,a-KG被廣泛使用。a-KG的主要制備方法為化學(xué)法和微生物發(fā)酵法。發(fā)酵法研究的較多的是真核微生物,而對(duì)于利用原核微生物中谷氨酸棒狀桿菌制備a-KG的方法,國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道較少。本論文以敲除谷氨酸脫氫酶I編碼基因gdh的谷氨酸高產(chǎn)菌株Corynebacterium glutamicum GDK-9△gdh為出發(fā)菌株,通過(guò)分子改造和發(fā)酵過(guò)程控制兩方面研究該菌株積累a-KG的情況。主要研究結(jié)果如下：以GDK-9△gdh為出發(fā)菌株,敲除谷氨酸脫氫酶II的編碼基因gdhA,成功構(gòu)建菌株GDK-9△gdh△gdhA。在搖瓶及發(fā)酵罐的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,相比出發(fā)菌株,菌株GDK-9△gdh△gdhA的a-KG的積累量分別提高了10.99%和7.49%,副產(chǎn)物L(fēng)-谷氨酸含量降低了5.72%和15.78%,糖酸轉(zhuǎn)化率提高了7.13%和7.36%；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明敲除基因gdhA有助于增加α-KG積累,對(duì)副產(chǎn)物積累量的降低也有積極意義。谷丙轉(zhuǎn)氨酶可以催化丙氨酸與a-KG生成L-谷氨酸,從而降低目的產(chǎn)物a-KG的含量,同時(shí)增加副產(chǎn)物L(fēng)-谷氨酸的積累。從菌株GDK-9△gdh出發(fā),敲除谷丙轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因,構(gòu)建基因缺失菌株GDK-9△gdh△alaT,經(jīng)搖瓶及發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在alaT缺失菌株的副產(chǎn)物積累量降低的同時(shí),目的產(chǎn)物a-KG的合成量并未增加,同時(shí)菌體的生長(zhǎng)相比出發(fā)菌株較弱,說(shuō)明谷丙轉(zhuǎn)氨酶對(duì)菌體的生長(zhǎng)有重要作用,在敲除谷氨酸脫氫酶I的條件下,谷丙轉(zhuǎn)氨酶不是合成L-谷氨酸的主要反應(yīng)。谷氨酸合酶催化a-KG和谷氨酰胺生成谷氨酸是副產(chǎn)物生成的又一途徑,以GDK-9△gdh△gdhA為出發(fā)菌株,敲除谷氨酸合酶的編碼基因gogat,成功構(gòu)建菌株GDK-9△gdh△gdhA△gogat,在搖瓶發(fā)酵及發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,改造菌株的副產(chǎn)物L(fēng)-谷氨酸積累量降低,同時(shí)菌體的生長(zhǎng)與產(chǎn)酸也變?nèi)?說(shuō)明谷氨酸合酶可能與調(diào)控菌體的生長(zhǎng)因素有關(guān),改造菌株的產(chǎn)酸延滯表明該基因可能與谷氨酸大量合成有密切聯(lián)系。在GDK-9△gdh的基礎(chǔ)上,敲除異檸檬酸裂解酶的編碼基因aceA,成功構(gòu)建菌株GDK-9△gdh△aceA,在搖瓶及發(fā)酵罐的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,改造菌株的a-KG合成量分別提高了17.57%和4.07%,糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高了14.39%和9.09%。說(shuō)明敲除異檸檬酸裂解酶后,增加了合成目的產(chǎn)物的主碳代謝流通量,有助于積累a-KG。為進(jìn)一步提高菌體積累a-KG的能力,以GDK-9△gdh△aceA為出發(fā)菌株,過(guò)表達(dá)編碼檸檬酸合酶的基因prpc,構(gòu)建了過(guò)表達(dá)菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19prpc和空質(zhì)粒菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19,通過(guò)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在搖瓶發(fā)酵和發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中,prpc過(guò)表達(dá)菌株和空質(zhì)粒菌株相比,a-KG的合成量分別提高了10.19%和3.69%,糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高了7.68%和6.51%。選擇GDK-9△gdh△gdhA為供試菌株,研究了雙階段pH和生物素控制策略下菌體的產(chǎn)酸情況,結(jié)果表明,雙階段pH控制法相比較于單階段pH控制法所獲得的L-谷氨酸減少了80.11%,α-KG積累增加了67.31%,糖酸轉(zhuǎn)化率提高了55.86%。在雙階段pH控制條件下,研究確定了發(fā)酵初始培養(yǎng)基中的最適生物素濃度為7μg/L,在發(fā)酵后期16 h-26 h時(shí)期內(nèi)添加生物素的最適濃度為5μg/L。在最終的發(fā)酵結(jié)果中使用雙階段pH和生物素控制下的發(fā)酵過(guò)程糖酸轉(zhuǎn)化率相比較雙階段pH控制提高了7.82%。
【關(guān)鍵詞】：谷氨酸棒狀桿菌 α-酮戊二酸 L-谷氨酸 糖酸轉(zhuǎn)化率 敲除 生物素
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TQ921
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1 前言11-24
• 1.1 α-酮戊二酸的理化性質(zhì)11
• 1.2 α-酮戊二酸的應(yīng)用11-12
• 1.3 α-酮戊二酸的生產(chǎn)概況12-14
• 1.3.1 α-酮戊二酸的生產(chǎn)方法12-13
• 1.3.2 發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸的歷史13
• 1.3.3 α-酮戊二酸發(fā)酵生產(chǎn)菌株13-14
• 1.4 α-酮戊二酸的合成途徑及代謝調(diào)控機(jī)制14-17
• 1.4.1 α-酮戊二酸的合成途徑14-15
• 1.4.2 α-酮戊二酸合成的代謝調(diào)控機(jī)制15-17
• 1.5 α -酮戊二酸生產(chǎn)菌的生化特性及育種思路17-18
• 1.5.1 α-酮戊二酸生產(chǎn)菌具備的生化特征17
• 1.5.2 α-酮戊二酸生產(chǎn)菌的育種思路17-18
• 1.6 α-酮戊二酸的發(fā)酵優(yōu)化策略18-21
• 1.6.1 α-酮戊二酸生產(chǎn)的培養(yǎng)基18-20
• 1.6.2 α-酮戊二酸發(fā)酵條件優(yōu)化20-21
• 1.7 α-酮戊二酸的測(cè)定方法21-22
• 1.8 論文立題依據(jù)及主要研究?jī)?nèi)容22-24
• 1.8.1 立題依據(jù)22-23
• 1.8.2 主要研究?jī)?nèi)容23-24
• 2 材料與方法24-42
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料24-30
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒24-25
• 2.1.2 主要儀器25-26
• 2.1.3 主要試劑26-28
• 2.1.4 主要溶液28-29
• 2.1.5 主要培養(yǎng)基29-30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法30-39
• 2.2.1 質(zhì)粒提取30
• 2.2.2 谷氨酸棒狀桿菌基因組的提取30-31
• 2.2.3 PCR擴(kuò)增31-34
• 2.2.4 DNA限制性內(nèi)切酶酶切34
• 2.2.5 瓊脂糖凝膠電泳34
• 2.2.6 DNA的回收純化34-35
• 2.2.7 連接與轉(zhuǎn)化35-36
• 2.2.8 感受態(tài)細(xì)胞制備36-37
• 2.2.9 重組質(zhì)粒的構(gòu)建37
• 2.2.10 轉(zhuǎn)化子鑒定37-38
• 2.2.11 目的基因測(cè)序38
• 2.2.12 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化及基因缺失菌株的篩選38-39
• 2.3 發(fā)酵培養(yǎng)方法39
• 2.3.1 斜面活化培養(yǎng)39
• 2.3.2 搖瓶與發(fā)酵罐的種子培養(yǎng)39
• 2.3.3 搖瓶補(bǔ)料分批發(fā)酵39
• 2.3.4 發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵39
• 2.4 分析方法39-42
• 2.4.2 菌體干重的計(jì)算39-40
• 2.4.3 培養(yǎng)液pH的測(cè)定40
• 2.4.4 殘?zhí)堑臏y(cè)定40
• 2.4.5 有機(jī)酸的測(cè)定40
• 2.4.6 氨基酸的測(cè)定40-41
• 2.4.7 數(shù)據(jù)分析41-42
• 3 結(jié)果與討論42-63
• 3.1 菌株GDK-9△gdh△gdhA的構(gòu)建及發(fā)酵實(shí)驗(yàn)42-47
• 3.1.1 重組片段△gdhA的構(gòu)建42-43
• 3.1.2 重組質(zhì)粒pK18mobsacB△gdhA的構(gòu)建43-44
• 3.1.3 重組菌株GDK-9△gdh△gdhA的構(gòu)建44-45
• 3.1.4 重組菌株GDK-9△gdh△gdhA和GDK-9△gdh的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)45-46
• 3.1.5 重組菌株GDK-9△gdh△gdhA和GDK-9△gdh的5L發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)46-47
• 3.1.6 重組菌株GDK-9△gdh△gdhA的發(fā)酵結(jié)果討論47
• 3.2 alaT基因敲除菌株GDK-9△gdh△alaT的構(gòu)建及發(fā)酵實(shí)驗(yàn)47-50
• 3.2.1 重組片段△alaT的構(gòu)建47-48
• 3.2.2 重組質(zhì)粒pK18mobsacB△alaT的構(gòu)建48
• 3.2.3 重組菌株GDK-9△gdh△alaT的構(gòu)建48-49
• 3.2.4 重組菌株GDK-9△gdh△alaT的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)49
• 3.2.5 重組菌株GDK-9△gdh△alaT的5 L發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)49
• 3.2.6 重組菌株GDK-9△gdh△alaT的發(fā)酵發(fā)酵結(jié)果討論49-50
• 3.3 菌株GDK-9△gdhAgdhA△gogat的構(gòu)建及發(fā)酵實(shí)驗(yàn)50-52
• 3.3.1 重組菌株GDK-9△gdh△gdhA△gogat的構(gòu)建50-51
• 3.3.2 重組菌株GDK-9△gdh△gdhA△gogat的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)51
• 3.3.3 重組菌株GDK-9△gdh△gdhA△gogat的5L發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)51-52
• 3.3.4 重組菌株GDK-9△gdh△gdhA△gogat的發(fā)酵結(jié)果討論52
• 3.4 菌株GDK-9△gdh△aceA的構(gòu)建52-54
• 3.4.1 重組片段△aceA的構(gòu)建52-53
• 3.4.2 重組質(zhì)粒pK18mobsacB△aceA的構(gòu)建53
• 3.4.3 重組菌GDK-9△gdh△aceA的構(gòu)建53
• 3.4.4 重組菌株GDK-9△gdh△aceA的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)53-54
• 3.4.5 重組菌株GDK-9△gdh△aceA的5L發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)54
• 3.4.6 重組菌株GDK-9△gdh△aceA的發(fā)酵結(jié)果總結(jié)54
• 3.5 過(guò)表達(dá)菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19prpc和空質(zhì)粒菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19的構(gòu)建54-57
• 3.5.1 重組質(zhì)粒pXMJ19prpc的構(gòu)建55
• 3.5.2 重組質(zhì)粒pXMJ19prpc及空質(zhì)粒pXMJ19的電轉(zhuǎn)化及重組菌株的篩選55-56
• 3.5.3 過(guò)表達(dá)菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19prpc和空質(zhì)粒菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)56
• 3.5.4 過(guò)表達(dá)菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19prpc和空質(zhì)粒菌株GDK-9△gdh△aceApXMJ19的5L發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)56-57
• 3.5.5 基因prpc過(guò)表達(dá)菌株的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論57
• 3.6 重組菌株GDK-9△gdh△gdhA的雙階段pH和生物素發(fā)酵控制57-63
• 3.6.1 重組菌株GDK-9△gdh△gdhA的雙階段pH發(fā)酵控制實(shí)驗(yàn)58
• 3.6.2 在發(fā)酵初期的生物素控制實(shí)驗(yàn)58-60
• 3.6.3 在發(fā)酵中后期添加生物素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)α-KG的影響60-62
• 3.6.4 雙階段pH和生物素控制條件下的發(fā)酵過(guò)程62-63
• 4 結(jié)論63-65
• 5 展望65-66
• 6 參考文獻(xiàn)66-73
• 7 攻讀研究生期間論文發(fā)表情況73-74
• 8 致謝74

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本文編號(hào)：565812