番茄因其富含番茄紅素等一系列重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),是一種備受歡迎的世界性經(jīng)濟(jì)作物。但其成熟后極易腐爛變質(zhì),不耐運(yùn)輸和儲(chǔ)藏,由此造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此如何延長(zhǎng)果實(shí)貨架期及保證其關(guān)鍵品質(zhì)一直是食品領(lǐng)域中重要的研究方向。目前,乙烯(C2H4)被認(rèn)為是促進(jìn)番茄成熟的重要植物激素,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其受體(LeETR3)與果實(shí)成熟密切相關(guān)。另一方面,番茄紅素β-環(huán)化酶(Lcyb)是代謝番茄紅素形成具環(huán)類胡蘿卜素的關(guān)鍵酶,對(duì)于番茄紅素水平調(diào)控至關(guān)重要。因此本文第一部分試圖運(yùn)用生物學(xué)方法CRISPR/Cas9技術(shù)同時(shí)突變LeETR3與Lcyb以期達(dá)到延遲果實(shí)成熟并保證其番茄紅素含量的目的。本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了含潮霉素(Hyg)抗性的CRISPR/Cas9Pubi::AtU::LeETR3/Lcyb共敲除載體,但在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)番茄AC對(duì)Hyg極其敏感,且Hyg篩選AC陽(yáng)性愈傷組織的最適濃度范圍在5 mg/L以下,不易篩選。因此本文又構(gòu)建了含卡那(Kana)抗性的CRISPR/Cas9P35s::AtU::LeETR3/Lcyb,CRISPR/Cas9::AtU::LeETR3多靶點(diǎn)敲除載體,并將其成功轉(zhuǎn)入番茄中...

【文章頁(yè)數(shù)】：79 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
ABSTRACT
英文縮寫符號(hào)及中英文對(duì)照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 延長(zhǎng)番茄貨架期及提高番茄品質(zhì)的研究進(jìn)展
        1.1.1 番茄的作用及儲(chǔ)存現(xiàn)狀
        1.1.2 番茄紅素的作用及意義
        1.1.3 番茄成熟的影響因子
        1.1.4 延長(zhǎng)番茄貨架期的常用方法
        1.1.5 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展
        1.1.6 基因編輯技術(shù)的簡(jiǎn)介
        1.1.7 CRISPR/Cas技術(shù)的研究進(jìn)展
    1.2 MDHAR的功能及其相關(guān)基因的研究進(jìn)展
        1.2.1 抗壞血酸的簡(jiǎn)介
        1.2.2 MDHAR的簡(jiǎn)介
    1.3 本研究的目的、內(nèi)容及意義
第二章 果實(shí)成熟和品質(zhì)相關(guān)基因LeETR3/Lcyb共敲除載體構(gòu)建
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 質(zhì)粒與菌株
    2.2 主要設(shè)備與儀器
    2.3 主要試劑
        2.3.1 分子生物學(xué)常用酶和試劑盒
        2.3.2 常用生化試劑
    2.4 常用試劑與培養(yǎng)基的配制
        2.4.1 SDS緩沖液配制
        2.4.2 TAE緩沖液配制
        2.4.3 MS常用試劑配制
        2.4.4 植物組織基本培養(yǎng)基配方
        2.4.5 LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方
    2.5 分子實(shí)驗(yàn)方法
        2.5.1 CRISPR/CAS9載體構(gòu)建基本步驟
        2.5.2 靶位點(diǎn)選擇及靶點(diǎn)引物設(shè)計(jì)
        2.5.3 質(zhì)粒提取
        2.5.4 表達(dá)盒與接頭靶點(diǎn)的連接
        2.5.5 表達(dá)盒的擴(kuò)增
        2.5.6 核酸檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳
        2.5.7 產(chǎn)物純化
        2.5.8 質(zhì)粒大提
        2.5.9 雙元載體的構(gòu)建
        2.5.10 農(nóng)桿菌EHA105化轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備
        2.5.11 雙元載體質(zhì)粒的農(nóng)桿感受態(tài)的化轉(zhuǎn)
    2.6 植物組織培養(yǎng)方法步驟
        2.6.1 發(fā)種子
        2.6.2 洗種子
        2.6.3 預(yù)培養(yǎng)
        2.6.4 侵染
        2.6.5 Kana篩選
        2.6.6 Hyg篩選
        2.6.7 生根
        2.6.8 移苗
    2.7 番茄培養(yǎng)條件
    2.8 結(jié)果與分析
        2.8.1 番茄目的基因靶位點(diǎn)的獲得
        2.8.2 植物表達(dá)載體CRISPR雙元載體構(gòu)建
        2.8.3 植物表達(dá)載體在番茄中的遺傳轉(zhuǎn)化
    2.9 結(jié)論
    2.10 討論與展望
第三章 獼猴桃基因MDHAR功能的初步解析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 質(zhì)粒與菌株
    3.2 主要設(shè)備
    3.3 主要試劑
        3.3.1 常用生化試劑
        3.3.2 抗壞血酸的測(cè)定試劑配方
        3.3.3 MDHAR測(cè)定Buffer配方
    3.4 試驗(yàn)方法
        3.4.1 MDHAR轉(zhuǎn)基因株系篩選
        3.4.2 引物設(shè)計(jì)
        3.4.3 Trizol法提取RNA
        3.4.4 mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA
        3.4.5 RT-PCR分析
        3.4.6 AsA測(cè)定
        3.4.7 植物中MDHAR酶活的測(cè)定
        3.4.8 擬南芥的培養(yǎng)條件
    3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.5.1 RT-PCR分析MDHAR的表達(dá)情況
        3.5.2 轉(zhuǎn)基因株系的MDHAR酶活測(cè)定分析
        3.5.3 轉(zhuǎn)基因株系的AsA測(cè)定分析
    3.6 結(jié)論
    3.7 討論與展望
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間的學(xué)術(shù)活動(dòng)及成果情況



本文編號(hào)：3828284