本文利用實驗室前期從蘿卜泡菜中篩選出一株具有降解亞硝酸鹽能力的植物乳桿菌為研究材料,根據(jù)GenBank中亞硝酸鹽還原酶（nir）基因序列,利用生物信息學軟件設計引物。提取植物乳桿菌的DNA,采用PCR技術(shù)擴增亞硝酸鹽還原酶（nir）基因,TA克隆獲得重組質(zhì)粒pMD19-nir,分析亞硝酸鹽還原酶核苷酸序列的同源性。通過雙酶切連接到表達載體pET-32a（+）中,獲得重組表達質(zhì)粒pET-32a（+）-nir,然后轉(zhuǎn)化至E.coli BL（DE3）。由于目的蛋白形成了包涵體,對其進行純化,然后進行酶學性質(zhì)的初步分析,主要結(jié)論如下：（1）根據(jù)GenBank中Lactobacillus plantarum WCFS1全部基因序列,設計特異性引物。采用PCR技術(shù)擴增亞硝酸鹽還原酶（nir）基因,通過TA克隆獲得重組質(zhì)粒pMD19-nir。對重組質(zhì)粒進行測序,然后用軟件分析測序結(jié)果：亞硝酸鹽還原酶（nir）基因開放閱讀框（ORF）堿基的長度為1638bp,序列經(jīng)NCBI Blast比對,與其它nir（JX434610-1）的最高同源性為99%。即成功克隆出亞硝酸鹽還原酶的基因。（2）雙酶切T克隆質(zhì)... 

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫詞說明
1 前言
    1.1 文獻綜述
        1.1.1 四川泡菜概述
        1.1.2 亞硝酸鹽的來源
        1.1.3 亞硝酸鹽的危害
        1.1.4 硝酸鹽降解方法的研究
        1.1.5 硝酸鹽還原酶的研究進展
    1.2 研究目的和意義
    1.3 研究內(nèi)容與技術(shù)路線
        1.3.1 實驗的研究內(nèi)容
        1.3.2 實驗技術(shù)路線
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 供試菌種及克隆載體
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 試劑和培養(yǎng)基的配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 亞硝酸鹽還原酶基因的克隆
        2.2.2 亞硝酸鹽還原酶基因的原核表達
        2.2.3 重組酶的純化
        2.2.4 重組酶的酶學性質(zhì)研究
3 結(jié)果與分析
    3.1 亞硝酸鹽還原酶(nir)基因的克隆
        3.1.1 亞硝酸鹽還原酶(nir)基因的擴增
        3.1.2 T克隆的PCR鑒定
        3.1.3 T克隆的雙酶切鑒定及序列比對結(jié)果
    3.2 亞硝酸鹽還原酶(nir)基因的表達
        3.2.1 重組質(zhì)粒pET-32a(+)-nir的PCR鑒定
        3.2.2 重組質(zhì)粒pET-32a-nir的雙酶切鑒定
        3.2.3 亞硝酸鹽還原酶在大腸桿菌中的表達
    3.3 重組酶的純化
        3.3.1 重組酶純化后的電泳檢測
    3.4 重組酶的酶學性質(zhì)分析結(jié)果
        3.4.1 亞硝酸鈉的標準曲線
        3.4.2 不同溫度對重組酶酶活的影響
        3.4.3 不同pH值對重組酶酶活的影響
        3.4.4 Km值的測定
4 討論
    4.1 亞硝酸鹽還原酶基因的克隆和表達
    4.2 包涵體的純化
    4.3 酶學性質(zhì)的分析
    4.4 酶活力的分析
5 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表的學術(shù)論文
附錄


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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[3]快速降解亞硝酸鹽的菌種選育及亞硝酸鹽還原酶的分離純化研究[D]. 相苒.吉林農(nóng)業(yè)大學 2013
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[7]植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶編碼基因的研究[D]. 何婷婷.上海師范大學 2012
[8]產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶短乳桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化及酶的分離純化研究[D]. 呂玉濤.上海師范大學 2010
[9]發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的生成及降解機理研究[D]. 馬延巖.天津科技大學 2010
[10]產(chǎn)亞硝酸還原酶菌株發(fā)酵特性及酶在肉制品中的應用[D]. 鄭懷忠.集美大學 2009



本文編號：3655822