本文利用實(shí)驗(yàn)室前期從蘿卜泡菜中篩選出一株具有降解亞硝酸鹽能力的植物乳桿菌為研究材料,根據(jù)GenBank中亞硝酸鹽還原酶（nir）基因序列,利用生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)引物。提取植物乳桿菌的DNA,采用PCR技術(shù)擴(kuò)增亞硝酸鹽還原酶（nir）基因,TA克隆獲得重組質(zhì)粒pMD19-nir,分析亞硝酸鹽還原酶核苷酸序列的同源性。通過(guò)雙酶切連接到表達(dá)載體pET-32a（+）中,獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）-nir,然后轉(zhuǎn)化至E.coli BL（DE3）。由于目的蛋白形成了包涵體,對(duì)其進(jìn)行純化,然后進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的初步分析,主要結(jié)論如下：（1）根據(jù)GenBank中Lactobacillus plantarum WCFS1全部基因序列,設(shè)計(jì)特異性引物。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增亞硝酸鹽還原酶（nir）基因,通過(guò)TA克隆獲得重組質(zhì)粒pMD19-nir。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,然后用軟件分析測(cè)序結(jié)果：亞硝酸鹽還原酶（nir）基因開放閱讀框（ORF）堿基的長(zhǎng)度為1638bp,序列經(jīng)NCBI Blast比對(duì),與其它nir（JX434610-1）的最高同源性為99%。即成功克隆出亞硝酸鹽還原酶的基因。（2）雙酶切T克隆質(zhì)... 

【文章頁(yè)數(shù)】：58 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫詞說(shuō)明
1 前言
    1.1 文獻(xiàn)綜述
        1.1.1 四川泡菜概述
        1.1.2 亞硝酸鹽的來(lái)源
        1.1.3 亞硝酸鹽的危害
        1.1.4 硝酸鹽降解方法的研究
        1.1.5 硝酸鹽還原酶的研究進(jìn)展
    1.2 研究目的和意義
    1.3 研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線
        1.3.1 實(shí)驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容
        1.3.2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 供試菌種及克隆載體
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 試劑和培養(yǎng)基的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 亞硝酸鹽還原酶基因的克隆
        2.2.2 亞硝酸鹽還原酶基因的原核表達(dá)
        2.2.3 重組酶的純化
        2.2.4 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究
3 結(jié)果與分析
    3.1 亞硝酸鹽還原酶(nir)基因的克隆
        3.1.1 亞硝酸鹽還原酶(nir)基因的擴(kuò)增
        3.1.2 T克隆的PCR鑒定
        3.1.3 T克隆的雙酶切鑒定及序列比對(duì)結(jié)果
    3.2 亞硝酸鹽還原酶(nir)基因的表達(dá)
        3.2.1 重組質(zhì)粒pET-32a(+)-nir的PCR鑒定
        3.2.2 重組質(zhì)粒pET-32a-nir的雙酶切鑒定
        3.2.3 亞硝酸鹽還原酶在大腸桿菌中的表達(dá)
    3.3 重組酶的純化
        3.3.1 重組酶純化后的電泳檢測(cè)
    3.4 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果
        3.4.1 亞硝酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線
        3.4.2 不同溫度對(duì)重組酶酶活的影響
        3.4.3 不同pH值對(duì)重組酶酶活的影響
        3.4.4 Km值的測(cè)定
4 討論
    4.1 亞硝酸鹽還原酶基因的克隆和表達(dá)
    4.2 包涵體的純化
    4.3 酶學(xué)性質(zhì)的分析
    4.4 酶活力的分析
5 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
附錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]大蒜對(duì)蔬菜亞硝酸鹽消除作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 詹秀環(huán),付星鋒,王子云.  中國(guó)調(diào)味品. 2015(01)
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[10]腌制水產(chǎn)品中N-亞硝胺物質(zhì)的危害分析及預(yù)防控制[J]. 王秀元,蔣玲波,王萍亞,趙華.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2013(03)

碩士論文
[1]干酪乳桿菌LCR 6013降解亞硝酸鹽的途徑及其亞硝酸鹽還原酶的表征[D]. 張馨月.華南理工大學(xué) 2014
[2]腌制食品中亞硝酸鹽生物降解的研究[D]. 蘇肖晶.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[3]快速降解亞硝酸鹽的菌種選育及亞硝酸鹽還原酶的分離純化研究[D]. 相苒.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[4]發(fā)酵蘿卜中亞硝酸鹽的變化規(guī)律及相關(guān)微生物的分離和發(fā)酵特性研究[D]. 郭雙霜.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[5]植物乳桿菌中亞硝酸還原酶的研究[D]. 丁少南.上海師范大學(xué) 2013
[6]乳酸菌制劑發(fā)酵泡菜工藝及安全性研究[D]. 李文婷.西華大學(xué) 2012
[7]植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶編碼基因的研究[D]. 何婷婷.上海師范大學(xué) 2012
[8]產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶短乳桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化及酶的分離純化研究[D]. 呂玉濤.上海師范大學(xué) 2010
[9]發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的生成及降解機(jī)理研究[D]. 馬延巖.天津科技大學(xué) 2010
[10]產(chǎn)亞硝酸還原酶菌株發(fā)酵特性及酶在肉制品中的應(yīng)用[D]. 鄭懷忠.集美大學(xué) 2009



本文編號(hào)：3655822