本文關(guān)鍵詞：瓊膠酶高產(chǎn)菌株的選育和紅藻寡糖的酶法制備與分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：紫菜、龍須菜等紅藻養(yǎng)殖業(yè)在我國沿海一帶發(fā)展迅速,產(chǎn)量增長迅速。多糖是紅藻中含量最多的成分之一。紅藻多糖具有較好的生物活性和重要的開發(fā)價值,但由于其分子量大,粘度高,難以進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞發(fā)揮作用,其開發(fā)應(yīng)用受到了限制。因此,降低紅藻多糖的分子量和粘度成為了開發(fā)利用紅藻多糖的關(guān)鍵。瓊膠酶的開發(fā)對于紅藻的高值化利用意義深遠(yuǎn)。本論文從產(chǎn)酶菌株的篩選、鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化、酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)、紅藻多糖的提取和降解、酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究。1.通過平板初篩和搖瓶復(fù)篩從青島近海的紅藻樣品中篩選出了一株高產(chǎn)瓊膠酶菌株,并對其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,結(jié)構(gòu)顯示該菌株屬于假交替單胞菌,命名為Pseudoalteromonas sp. QJ97。通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗相結(jié)合的手段確立了Pseudoalteromonas sp. QJ97最佳發(fā)酵條件為瓊脂3.96g/L、乳糖4.0 g/L、NH4NO3 2.0 g/L、K2HPO4 1.5 g/L, NaCl 11.27 g/L,溫度31℃接種量2%、裝液量30 mL、pH 8.0、轉(zhuǎn)速160 r/min。在最佳條件下發(fā)酵24 h,發(fā)酵液的酶活力為625.93 U/mL,是優(yōu)化前的2.02倍。通過測定Pseudoalteromonas sp.QJ97的生長曲線和產(chǎn)酶曲線可知在發(fā)酵過程中該菌株在28 h達(dá)到生物量的最高值,在32 h達(dá)到產(chǎn)酶量最高值。2.通過丙酮沉淀、Q-Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過濾層析等方法對菌株QJ97的發(fā)酵液進(jìn)行了分離純化,得到了電泳純度的瓊膠酶。該瓊膠酶的純化倍數(shù)為11.18,比活力為23922.00 U/mg。電泳結(jié)果表明酶的相對分子質(zhì)量約為35 kDa,該分子量不同于以往的報道。然后對純化后的瓊膠酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明：瓊膠酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別為40℃,6.0。該瓊膠酶對NaCl有很強(qiáng)的耐受性。Ca2+, Mg2*, Ba2+和K+對酶活力影響很小,Zn2+, Cu2+, Mn2+和Fe3+的存在都會抑制瓊膠酶的活性。低濃度的Co2+對瓊膠酶幾乎無影響,但高濃度的Co2+會強(qiáng)烈抑制瓊膠酶的活性。低濃度的SDS可使瓊膠酶完全失活。瓊膠酶對EDTA相對穩(wěn)定。瓊膠酶的Km和Vmax分別為5.361g/L,0.244 g/L/min。該瓊膠酶具有較強(qiáng)的底物專一性,可高效降解瓊膠,對褐藻酸鈉、卡拉膠、殼聚糖、羧甲基纖維素、明膠和可溶性淀粉均無降解作用。3.通過單因素試驗確定了紫菜多糖(PHP)、龍須菜多糖(GLP)和石花菜多糖(GAP)進(jìn)行熱水提取的最佳料液比分別為1：40,1：30,1：30,浸提時間為4 h。通過對紅藻多糖酶解條件的研究,確立了紅藻多糖酶解的最佳工藝條件為：酶添加量4%,酶解溫度40℃,體系pH 6.0,酶解時間2 h。對乙醇沉淀的工藝進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明三種酶解液的最佳濃縮倍數(shù)分別為4,5,5,最佳pH為8,乙醇倍數(shù)應(yīng)選擇4為宜。4.通過高效液相色譜(HPLC)技術(shù)對三種紅藻多糖的單糖組成進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示PHP、GLP和GAP均以半乳糖作為主要成分,含量分別為93.0%,78.7%,79.3%。利用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)技術(shù)對酶解產(chǎn)物各分級組分的成分進(jìn)行了分析,并結(jié)合抗氧化實驗和抑菌實驗結(jié)果對紅藻多糖酶解產(chǎn)物的活性和結(jié)構(gòu)的關(guān)系進(jìn)行了探討。結(jié)果表明紅藻多糖及其酶解產(chǎn)物的.OH清除能力與樣品濃度均呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。通過縱向?qū)Ρ韧患t藻多糖的酶解產(chǎn)物各分級組分的結(jié)構(gòu)和活性的大小關(guān)系,以及橫向?qū)Ρ热t藻多糖酶解產(chǎn)物中活性最大的組分的結(jié)構(gòu)和活性的大小關(guān)系,明確了樣品.OH清除能力的影響因素。整體而言,聚合度大小和硫酸基含量降低,.OH清除能力呈下降趨勢。聚合度8-16的偶數(shù)糖可能有較強(qiáng)的羥自由基清除能力。除此以外,紅藻寡糖的單糖組成也可能影響紅藻寡糖的.OH清除能力。紅藻多糖對所有供試菌株無抑制作用,但經(jīng)過降解后獲得的部分寡糖樣品對四聯(lián)球菌表現(xiàn)出了較明顯的抑菌效果。通過測定各組分的MIC值并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和抑菌活性的對比,結(jié)果表明聚合度大小和硫酸基含量對抑菌活性存在影響,聚合度6-16的偶數(shù)糖可能具有較好的抑菌效果,聚合度大小較硫酸基含量對抑菌活性的影響更大。
【關(guān)鍵詞】：瓊膠酶 假交替單胞菌 分離純化 酶學(xué)性質(zhì) 結(jié)構(gòu) 活性
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TS254.1
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 0 前言14-31
• 0.1 瓊膠酶的研究現(xiàn)狀及研究意義14-20
• 0.1.1 瓊膠酶的主要來源14-15
• 0.1.2 菌株產(chǎn)酶能力的測定15-16
• 0.1.3 天然瓊膠酶的特征16-18
• 0.1.4 瓊膠酶的理論研究進(jìn)展18
• 0.1.5 瓊膠酶理論研究的現(xiàn)實意義18-20
• 0.2 紅藻多糖及降解產(chǎn)物的研究進(jìn)展20-24
• 0.2.1 紅藻多糖的結(jié)構(gòu)與活性20-22
• 0.2.2 紅藻多糖的降解22-23
• 0.2.3 紅藻寡糖的構(gòu)效關(guān)系研究23-24
• 0.3 立題依據(jù)及研究內(nèi)容24-26
• 0.3.1 立題依據(jù)和意義24-25
• 0.3.2 研究內(nèi)容25-26
• 參考文獻(xiàn)26-31
• 1 高產(chǎn)瓊膠酶菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化31-56
• 1.1 引言31
• 1.2 材料與儀器31-32
• 1.2.1 試劑31-32
• 1.2.2 主要儀器32
• 1.2.3 培養(yǎng)基32
• 1.3 方法32-37
• 1.3.1 樣品采集32-33
• 1.3.2 平板初篩33
• 1.3.3 復(fù)篩33
• 1.3.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制33-34
• 1.3.5 瓊膠酶活力的測定方法34
• 1.3.6 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定34
• 1.3.7 分子生物學(xué)鑒定34-35
• 1.3.8 傳代數(shù)對菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性的影響35
• 1.3.9 單因素優(yōu)化35-37
• 1.3.10 響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵條件37
• 1.3.11 菌株QJ97的生長曲線和產(chǎn)酶曲線的測定37
• 1.4 結(jié)果與分析37-53
• 1.4.1 高產(chǎn)瓊膠酶菌株的篩選37-38
• 1.4.2 菌株QJ97的形態(tài)學(xué)特征38-39
• 1.4.3 菌株QJ97 16S rDNA的測序結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化樹39-40
• 1.4.4 產(chǎn)酶穩(wěn)定性結(jié)果40-41
• 1.4.5 培養(yǎng)基組成優(yōu)化41-46
• 1.4.6 培養(yǎng)條件優(yōu)化46-48
• 1.4.7 響應(yīng)面優(yōu)化48-52
• 1.4.8 菌株QJ97的生長曲線及產(chǎn)酶曲線52-53
• 1.5 本章小結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-56
• 2 瓊膠酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究56-72
• 2.1 引言56
• 2.2 材料與儀器56-57
• 2.2.1 材料56-57
• 2.2.2 儀器57
• 2.3 方法57-60
• 2.3.1 酶活力的測定57
• 2.3.2 蛋白含量的測定57-58
• 2.3.3 粗酶液的制備58
• 2.3.4 瓊膠酶的分離純化58-59
• 2.3.5 SDS-PAGE測定瓊膠酶的分子量59
• 2.3.6 酶學(xué)性質(zhì)研究59-60
• 2.4 結(jié)果與分析60-69
• 2.4.1 丙酮沉淀結(jié)果60-61
• 2.4.2 Q-Sepharose Fast Flow離子交換層析61-62
• 2.4.3 Sephadex G-75凝膠過濾層析62
• 2.4.4 Pseudoalteromonas sp.QJ97所產(chǎn)瓊膠酶的純化結(jié)果62-63
• 2.4.5 SDS-PAGE電泳63-64
• 2.4.6 酶學(xué)性質(zhì)研究64-69
• 2.5 本章小結(jié)69-70
• 參考文獻(xiàn)70-72
• 3 紅藻多糖的提取及其酶降解工藝研究72-84
• 3.1 引言72
• 3.2 材料與儀器72-73
• 3.2.1 材料72-73
• 3.2.2 儀器73
• 3.3 方法73-76
• 3.3.1 還原糖的質(zhì)量濃度73
• 3.3.2 總糖的質(zhì)量濃度73-74
• 3.3.3 多糖得率的計算74
• 3.3.4 還原糖得率的計算74
• 3.3.5 紅藻多糖的熱水提取74
• 3.3.6 紅藻多糖的制備74-75
• 3.3.7 紅藻多糖的酶法降解75
• 3.3.8 紅藻多糖的酶解及乙醇分級沉淀75-76
• 3.4 結(jié)果與分析76-82
• 3.4.1 紅藻多糖的熱水提取76-77
• 3.4.2 紅藻多糖的酶法降解77-80
• 3.4.3 乙醇沉淀工藝優(yōu)化80-82
• 3.5 本章小結(jié)82-83
• 參考文獻(xiàn)83-84
• 4 紅藻寡糖結(jié)構(gòu)和活性的關(guān)系研究84-103
• 4.1 引言84
• 4.2 材料與儀器84-85
• 4.2.1 材料84-85
• 4.2.2 儀器85
• 4.3 方法85-89
• 4.3.1 紅藻多糖的酶降解及產(chǎn)物的分級沉淀85-88
• 4.3.2 酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析88
• 4.3.3 紅藻多糖及其酶解產(chǎn)物羥自由基(·OH)清除能力測定88-89
• 4.3.4 紅藻多糖及其酶解產(chǎn)物抑菌活性的測定89
• 4.4 結(jié)果與分析89-100
• 4.4.1 紅藻多糖的HPLC分析89-91
• 4.4.2 酶解產(chǎn)物的ESI-MS分析91-96
• 4.4.3 紅藻多糖及其酶解產(chǎn)物的·OH清除能力與結(jié)構(gòu)的關(guān)系96-98
• 4.4.4 紅藻多糖及其酶解產(chǎn)物的抑菌活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系98-100
• 4.5 本章小結(jié)100-101
• 參考文獻(xiàn)101-103
• 結(jié)語與展望103-104
• 論文創(chuàng)新點104-105
• 致謝105-106
• 個人簡歷106
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果106

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本文編號：315800