水體富營養(yǎng)化加劇致使藍(lán)藻水華頻繁暴發(fā),產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物——微囊藻毒素（microcystins,MCs）對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)與公眾健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。微生物作為生物群落中的分解者,在MCs的自然降解中具有重要驅(qū)動(dòng)作用。通過DNA文庫篩選與基因異源表達(dá),在MCs降解菌中鑒定出編碼功能水解酶的mlr基因簇（mlrABCD）。其中,MlrA（亦稱microcystinase）負(fù)責(zé)催化起始反應(yīng),將環(huán)狀MCs水解為低毒性線性產(chǎn)物。前期研究從滇池底泥篩選獲得1株Sphingopyxis sp.USTB-05菌,該菌能遵循mlr機(jī)制對(duì)多種MCs進(jìn)行降解。然而,野生菌生理系統(tǒng)中酶系較為復(fù)雜,缺少對(duì)MlrA酶學(xué)性質(zhì)、活化機(jī)理、結(jié)構(gòu)特征與底物水解機(jī)制的相關(guān)認(rèn)識(shí),嚴(yán)重制約了相應(yīng)菌體或酶制劑在水體修復(fù)中的應(yīng)用。因此,針對(duì)以上問題,本研究采用基因工程技術(shù)將USTB-05菌的mlrA基因克隆至大腸桿菌,重組表達(dá)MlrA后研究了其酶學(xué)性質(zhì);然后,在分析了該酶同源性、序列性質(zhì)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的基礎(chǔ)上,利用計(jì)算結(jié)構(gòu)生物學(xué)模擬了MlrA的三維分子結(jié)構(gòu);最后,將MlrA與MC-LR進(jìn)行分子對(duì)接,提出了該酶的底物水解機(jī)理,并通過定點(diǎn)突... 

【文章來源】：江西理工大學(xué)江西省

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 研究背景
    1.2 微囊藻毒素概述
        1.2.1 種類與結(jié)構(gòu)
        1.2.2 生物合成機(jī)理與裝配過程
        1.2.3 環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)與毒理作用
    1.3 微囊藻毒素微生物降解研究現(xiàn)狀
        1.3.1 細(xì)菌
        1.3.2 真菌
        1.3.3 水生植物
        1.3.4 原生動(dòng)物
    1.4 細(xì)菌降解微囊藻毒素的功能基因與酶促途徑
        1.4.1 降解基因
        1.4.2 酶促途徑
    1.5 細(xì)菌微囊藻毒素降解酶MlrA的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究
        1.5.1 結(jié)構(gòu)特征
        1.5.2 功能特性
        1.5.3 活性位點(diǎn)
    1.6 研究目標(biāo)、內(nèi)容、意義及技術(shù)路線圖
        1.6.1 研究?jī)?nèi)容
        1.6.2 研究目標(biāo)
        1.6.3 研究意義
        1.6.4 技術(shù)路線圖
第二章 微囊藻毒素降解酶MlrA的原核表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)表征
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 主要化學(xué)試劑
        2.1.4 主要溶液
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 目的基因獲取
        2.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.3 重組菌的構(gòu)建及鑒定
        2.2.4 重組MlrA酶的表達(dá)與提取
        2.2.5 SDS-PAGE分析
        2.2.6 酶活性檢測(cè)
        2.2.7 液相色譜分析
        2.2.8 MC-RR的定量測(cè)定
        2.2.9 重組MlrA酶學(xué)性質(zhì)分析
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.2 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.3.3 酶催化活性檢測(cè)
        2.3.4 重組USTB-05-Mlr A的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性
        2.3.5 重組USTB-05-Mlr A的最適反應(yīng)p H及 p H穩(wěn)定性
        2.3.6 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)重組USTB-05-Mlr A催化活性的影響
    2.4 本章小結(jié)
第三章 微囊藻毒素降解酶MlrA的計(jì)算結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 蛋白質(zhì)信息數(shù)據(jù)庫
        3.1.2 生物信息分析軟件及工具
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 序列檢索
        3.2.2 氨基酸與結(jié)構(gòu)域分析
        3.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析
        3.2.4 酶分子模型的構(gòu)建與優(yōu)化
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 同源性分析
        3.3.2 序列比對(duì)及功能基因挖掘
        3.3.3 MlrA類似物的鑒定
        3.3.4 氨基酸理化特性
        3.3.5 MlrA的進(jìn)化關(guān)系
        3.3.6 分子結(jié)構(gòu)模擬
    3.4 本章小結(jié)
第四章 微囊藻毒素降解酶MlrA的底物水解機(jī)理
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌株與質(zhì)粒
        4.1.2 培養(yǎng)基
        4.1.3 主要化學(xué)試劑
        4.1.4 主要溶液
        4.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 模型分析
        4.2.2 活性位點(diǎn)分析
        4.2.3 分子對(duì)接
        4.2.4 定點(diǎn)突變
        4.2.5 MlrA點(diǎn)突變體的重組表達(dá)與提取
        4.2.6 MlrA點(diǎn)突變體的酶活分析
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 MlrA的結(jié)構(gòu)特征
        4.3.2 酶活性位點(diǎn)預(yù)測(cè)
        4.3.3 MlrA與 MC-LR的結(jié)合方式
        4.3.4 MlrA的底物水解機(jī)理
        4.3.5 MlrA點(diǎn)突變體的催化活性
        4.3.6 EDTA與MlrA的作用模式
    4.4 本章小結(jié)
第五章 結(jié)論與展望
    5.1 主要結(jié)論
    5.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
    5.3 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間的研究成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[7]富營養(yǎng)化湖泊中微囊藻毒素及其控制去除技術(shù)[J]. 蘇雅玲,鄧一榮.  環(huán)境科學(xué)與技術(shù). 2013(06)
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博士論文
[1]谷胱甘肽過氧化物酶突變體及其模擬物的表達(dá)與表征[D]. 郭笑.吉林大學(xué) 2015



本文編號(hào)：3148141