本文選題：Agrobacterium　切入點：tumefaciens　出處：《山東大學》2017年碩士論文

【摘要】：尼古丁是煙草及其廢物中含量最高的一種有毒生物堿,能使人對煙草產(chǎn)生依賴性。因其易溶于水,如果處理不當,會對環(huán)境和人體健康造成嚴重危害。微生物以其種類繁多、代謝類型多樣、適應(yīng)性強且不會造成二次污染等特點成為自然界中環(huán)境污染物降解的主要類群。Agrobacterium tumefaciensS33是本實驗室前期篩選獲得的一株能夠高效降解尼古丁的菌株,前期研究發(fā)現(xiàn)它以一種新的途徑——吡啶途徑與吡咯途徑的"雜合途徑"——降解尼古丁。本論文在前期研究的基礎(chǔ)上,對菌株A.tumefaciens S33降解尼古丁雜合途徑的生化機制進一步展開深入研究,為煙草廢物的處理與尼古丁的轉(zhuǎn)化利用提供更多的理論基礎(chǔ)。通過對A.tumefaciens S33的基因組重新完整測序發(fā)現(xiàn),該菌株基因組包含2條染色體,分別為2.49 Mbp的環(huán)狀染色體和2.98 Mbp的線性染色體。分析發(fā)現(xiàn),已經(jīng)鑒定的尼古丁降解基因(ndhB、ndhA、hno、pno和hsh)與轉(zhuǎn)座酶、接合轉(zhuǎn)移蛋白、質(zhì)粒分割和復制起始蛋白等蛋白的編碼基因形成一個大的基因簇,該基因簇位于環(huán)狀染色體的一個基因島上。此外,在該基因簇上還發(fā)現(xiàn)了其它參與尼古丁降解下游途徑的基因(iso、nfo、hpo和ami)。在獲得S33高質(zhì)量的完整基因組序列的基礎(chǔ)上,對之前測定的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了重新分析,結(jié)果顯示,在以尼古丁培養(yǎng)基培養(yǎng)時,S33環(huán)狀染色體上的尼古丁降解基因簇中的基因表達水平顯著上調(diào)。除上述已經(jīng)證實直接催化尼古丁降解的9個基因外,在該尼古丁降解基因簇中還發(fā)現(xiàn)了paz、ald等多個基因表達水平顯著上調(diào),分析推測它們也可能參與尼古丁降解過程。另外,在本實驗室前期研究的基礎(chǔ)上,對可能催化尼古丁降解第四步反應(yīng)的關(guān)鍵酶6-羥基假氧化尼古丁氧化酶(Pno)進行了異源表達和純化,全波長掃描結(jié)果顯示Pno含有典型的黃素和鐵硫簇的吸收峰。薄板層析和高效液相色譜分析結(jié)果顯示,每摩爾蛋白結(jié)合1.2molFMN;測定鐵含量結(jié)果顯示,每摩爾蛋白結(jié)合3.3 mol鐵,這些結(jié)果與預測的Pno結(jié)合有一分子FMN和一分子[4Fe4S]型鐵硫簇一致。酶活測定結(jié)果顯示,Pno能夠催化6-羥基假氧化尼古丁氧化生成6-羥基-3-琥珀酰半醛吡啶,以2,6-二氯酚靛酚為人工電子受體,該酶的催化活力可達32.2 U/mg,6-羥基假氧化尼古丁的表觀K?值為0.37 mM。此外,還對催化尼古丁降解起始反應(yīng)的關(guān)鍵酶尼古丁脫氫酶(NdhAB)進行了細胞定位和純化。采用高滲溶液、溶菌酶和EDTA處理菌株S33細胞,離心獲得周質(zhì)空間組分,通過短暫超聲破碎與超速離心分離制得細胞質(zhì)與細胞膜組分,通過對不同組分酶活的測定,發(fā)現(xiàn)66%的NdhAB酶活在周質(zhì)空間組分中,而90%左右的Pno和Hno酶活在細胞質(zhì)中。進一步對周質(zhì)空間組分中的NdhAB進行純化、酶活測定與質(zhì)譜鑒定,證實NdhAB在細胞質(zhì)內(nèi)合成后分泌到細胞的周質(zhì)空間發(fā)揮作用,而Pno和Hno則直接在細胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用,這與生物信息學分析發(fā)現(xiàn)NdhA的氮端含有典型的Tat信號肽的結(jié)果一致。有趣的是,通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),位于ndhAB基因上游與之相鄰的ORF被預測編碼電子傳遞蛋白假天青蛋白(Paz)。因該蛋白被預測含有信號肽,在細菌中通常也被分泌到周知空間,且其表達水平在尼古丁培養(yǎng)基中顯著上調(diào),推測它可能作為NdhAB的電子受體參與尼古丁降解。通過對Paz異源表達、周質(zhì)空間組分提取與純化,證實其定位于周質(zhì)空間。氮末端氨基酸序列分析顯示,從大腸桿菌周質(zhì)空間組分純化的成熟的重組Paz蛋白氮端的信號肽已經(jīng)被切除,全波長掃描發(fā)現(xiàn)該蛋白具有典型的Paz的特征吸收峰(450 nm、595 nm和770 nm),且A595nm/A280nm為0.24,完全氧化態(tài)的Paz在595 nm處的摩爾消光系數(shù)為3.58 mM-1 cm-1,每分子蛋白結(jié)合1分子銅。通過酶活測定及催化產(chǎn)物質(zhì)譜鑒定證實,Paz能夠作為NdhAB的生理電子受體參與尼古丁降解,催化活力可達110.5 U/mg,每氧化1 nmol尼古丁消耗2.2 nmol氧化態(tài)Paz。以Paz為電子受體時,測得的尼古丁的表觀Km值為1.64 μM,Paz的表觀Km值為3.61 μM。進一步的同位素標記實驗結(jié)果顯示,NdhAB催化尼古丁羥基化產(chǎn)物6-羥基尼古丁中的氧原子來自H20。這些結(jié)果確認,Paz在S33的周質(zhì)空間中作為NdhAB的生理電子受體參與尼古丁降解的第一步反應(yīng)。綜上結(jié)果,本論文對S33的基因組進行了完整測序,對前期測定的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了重新分析,通過酶純化及性質(zhì)研究對S33降解尼古丁雜合途徑的關(guān)鍵酶展開了詳細研究,首次詳細研究了 6-羥基假氧化尼古丁氧化酶Pno的生化性質(zhì)和催化功能;首次發(fā)現(xiàn)了尼古丁脫氫酶NdhAB被分泌到周質(zhì)空間中,并以假天青蛋白Paz作為生理電子受體催化尼古丁的羥基化反應(yīng),進一步揭示了菌株S33降解尼古丁雜合途徑的生化機制。
[Abstract]:This paper studies the biochemical mechanism of the degradation of nicotine in the environment and human body because it is easy to dissolve in water . It is found that the genome of the strain A and ndhA , hno , pno and hsh can be used to degrade nicotine . The gene cluster is located on a gene island of circular chromosome . On the basis of obtaining the complete genome sequence of high quality in S33 , the gene expression level of NdhAB was significantly increased . The results showed that the expression level of NdhAB was significantly up - regulated in the NdhAB gene cluster . The results showed that the NdhAB enzyme could be used to catalyze the degradation of nicotine . The results showed that the apparent Km value of NdhAB was 1.64渭M , and the apparent Km value was 3.61 渭M . The results showed that the apparent Km value of NdhAB was 1.64渭M and the apparent Km value was 3.61 渭M .

【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：X795;Q78

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 楊艷坤;席宇;張廣樂;郭靈燕;李秦;朱大恒;;微生物降解尼古丁的分子生物學研究進展[J];中國煙草科學;2010年04期

2 王書寧,杜毅,陳洪,許平;微生物代謝尼古丁研究進展[J];中國生物工程雜志;2004年07期

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本文編號：1684916