本文選題：2型糖尿病　切入點：胰高血糖素樣肽1　出處：《湖北工業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：2型糖尿病是最為常見的糖尿病類型,占糖尿病患者人數(shù)90%以上。胰高血糖素樣肽1(GLP-1)是一種小腸L型細(xì)胞所釋放的的天然腸促胰島素激素,能有效降低血糖,促進胰腺β細(xì)胞增殖,防止β細(xì)胞凋亡和延遲胃排空,在2型糖尿病的治療中具有良好的前景。然而,天然GLP-1在體內(nèi)易被二肽基肽酶4(DPP-4)降解,使半衰期僅為1至2分鐘,限制其臨床上的直接應(yīng)用,因此開發(fā)更穩(wěn)定的GLP-1類似物或緩釋制劑成為了近年來的研究熱點。利拉魯肽是銷量最好的酰化的人GLP-1類似物之一,與內(nèi)源性人GLP-1(7-37)具有97%的同源性,并具有良好的降糖效應(yīng)。雖然利拉魯肽的半衰期可達(dá)13小時,但仍需要一天注射一次,為了提高患者的順應(yīng)性和提高利拉魯肽的療效,因此有必要研究長效化多肽藥物。我們旨在制備利拉魯肽納米制劑,先通過基因工程制備利拉魯肽的前體,再通過化學(xué)修飾制備利拉魯肽,最后通過納米粒包埋利拉魯肽。利拉魯肽的前體,即GLP-1~(R34),多使用多肽固相合成方法以制備利拉魯肽前體。而在我們的研究中應(yīng)用了一種新方法,其中包括在大腸桿菌中將MFH-GLP-1~(R34)融合蛋白通過乳糖誘導(dǎo)并以包涵體形式表達(dá),GLP-1~(R34)的純化以及在GLP-1~(R34) 26號位通過谷氨酸介導(dǎo)接上棕櫚酸側(cè)鏈。該載體蛋白有助于利拉魯肽前體的過表達(dá),與IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)相比,乳糖誘導(dǎo)的表達(dá)對細(xì)胞顯示無毒性作用,且表達(dá)量相當(dāng)。通過優(yōu)化乳糖濃度、誘導(dǎo)時間、初始誘導(dǎo)細(xì)胞光密度值和培養(yǎng)基條件進行發(fā)酵罐培養(yǎng)融合蛋白,并通過分批補料最終獲得了10 g/L的菌體量。通過離子交換色譜法成功地純化了利拉魯肽前體,獲得90%以上的純度,并通過HPLC進行分離。我們的研究結(jié)果表明,通過離子交換制備利拉魯肽前體的工藝是經(jīng)濟又有效的。通過乳化溶劑蒸發(fā)法制備了聚乙醇酸羥基乙酸(PLGA)納米粒,并優(yōu)化了制備PLGA納米粒的工藝,包括溶劑、乳化劑濃度、稀釋比例,最終得到了均勻、粒徑小、穩(wěn)定性高的納米粒,并將其用于后續(xù)生物學(xué)活性實驗。綜上,本研究采用大腸桿菌作為利拉魯肽前體表達(dá)的宿主菌,相比傳統(tǒng)方法中在釀酒酵母中表達(dá)利拉魯肽前體要更加經(jīng)濟,采用離子交換方法純化利拉魯肽前體要更加簡便高效,并探索了PLGA納米粒的制備工藝,為長效GLP-1類似物藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Type 2 diabetes is the most common type of diabetes, accounting for more than 90% of the patients with diabetes. Glucagon like peptide 1 (GLP-1) is a natural intestinal insulin stimulating hormone released by L-type cells of the small intestine, which can effectively reduce blood glucose. Promoting pancreatic 尾 cell proliferation, preventing 尾 cell apoptosis and delayed gastric emptying have good prospects in the treatment of type 2 diabetes. However, natural GLP-1 is easily degraded by dipeptidyl peptidase 4 (DPP-4) in vivo, and the half-life is only 1 to 2 minutes. Therefore, the development of more stable GLP-1 analogues or slow-release preparations has become a hot topic in recent years. Lilaru peptide is one of the best-selling acylated human GLP-1 analogues, and has 97% homology with endogenous human GLP-1 7-37). And has a good hypoglycemic effect. Although the half-life of liraropeptide can be up to 13 hours, it still needs to be injected once a day, in order to improve the compliance of patients and improve the curative effect of liralutin. Therefore, it is necessary to study long-acting polypeptide drugs. Finally, a new method was applied in our research to prepare the precursor of Lilaru peptide, which is the precursor of Lilaru peptide, GLP-1, R34, which was encapsulated by nanocrystalline particles, and the solid phase synthesis method of polypeptide was used to prepare the precursor of Lilaru peptide. These include the purification of MFH-GLP-1 / R34) fusion protein induced by lactose and expressed as inclusion body in Escherichia coli, and the incorporation of palmitic acid side chain via glutamic acid mediated at GLP-1 / R34). The carrier protein contributes to the overexpression of Lilaru peptide precursor, Compared with the expression induced by IPTG, the expression induced by lactose showed no toxicity to cells, and the expression level was equal. The fusion protein was cultured in fermentor by optimizing the concentration of lactose, inducing time, initial optical density of induced cells and medium condition. Finally, 10 g / L biomass was obtained by batch feeding. The precursor was purified successfully by ion exchange chromatography, the purity was over 90%, and the purity was separated by HPLC. Our results show that, It is economical and effective to prepare the precursor of Lilaru peptide by ion exchange. Polyglycolic acid (PLGA) nanoparticles were prepared by emulsifying solvent evaporation method, and the process of preparing PLGA nanoparticles, including solvent and emulsifier concentration, was optimized. Finally, homogenous, small and stable nanoparticles were obtained by dilution ratio, and were used in the subsequent biological activity experiments. In summary, Escherichia coli was used as the host strain for the expression of Lilaru peptide precursor. Compared with the traditional methods, it is more economical to express the precursor of Lilaru peptide in Saccharomyces cerevisiae, and it is more convenient and efficient to purify the precursor of Lilaru peptide by ion exchange method, and the preparation process of PLGA nanoparticles is explored. It lays a foundation for the development of long-acting GLP-1 analogues.
【學(xué)位授予單位】：湖北工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TQ464.7

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本文編號：1647041