本文關鍵詞：沒食子酸脫羧酶（GAD）的分離及其酶學性質(zhì)研究

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【摘要】：五倍子是中國特色林產(chǎn)品,常用作制備沒食子酸(Gallic Acid)和焦性沒食子酸(Pyrogallol)的原料。焦性沒食子酸廣泛應用于農(nóng)藥、醫(yī)藥、化妝品、顯影劑、熱敏劑、高分子材料等領域。傳統(tǒng)上,焦性沒食子酸是通過沒食子酸在強酸和強堿催化下化學脫羧制得,該方法不僅產(chǎn)生大量高色度的廢水,嚴重污染環(huán)境,而且產(chǎn)品中催化劑殘留難以去除,金屬雜質(zhì)偏高。因此,本課題考察微生物轉(zhuǎn)化沒食子酸制備焦性沒食子酸的新工藝研究,篩選出產(chǎn)沒食子酸脫羧酶(Gallic Acid Decarboxylase,GAD)的高產(chǎn)菌株,分離純化GAD,并初步研究了GAD的結(jié)構(gòu)及其酶學性質(zhì),結(jié)果表明利用微生物降解沒食子酸制備焦性沒食子酸具有廣闊的發(fā)展前景。論文選擇特定的培養(yǎng)基(即CDM培養(yǎng)基,由0.06%Mg SO4·7H2O、0.4%(NH4)2SO4、0.2%沒食子酸及30 mmol·L-1 p H為6.6的磷酸鹽緩沖溶液組成),以沒食子酸作為唯一碳源進行底物誘導48 h,通過發(fā)酵液中沒食子酸降解率和焦性沒食子酸產(chǎn)率的變化,從腸桿菌屬(Enterobacter Spp.,E.Spp.)和檸檬酸桿菌屬(Citrobacter Spp.,C.Spp)中篩選出產(chǎn)GAD的產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter Aerogenes,E.Aerogenes)CICC23008,然后通過6個單因素的考察及響應面優(yōu)化,確定優(yōu)化工藝條件為接種量5%,底物濃度0.4%,磷酸鹽緩沖溶液含量25%(p H為6.6),發(fā)酵溫度32℃,發(fā)酵液初始p H=6,底物質(zhì)量分數(shù)0.32%,焦性沒食子酸平均收率為77.86%。論文重點研究了GAD的分析方法、提取和分離工藝及結(jié)構(gòu)表征。建立了考馬斯亮藍法測定GAD蛋白含量線性方程(Y=4.8485X+0.4865,R2=0.9943)和雙縮脲法測GAD蛋白含量線性方程(Y=0.2476X+0.0003,R2=0.9993)。對E.Aerogenes在優(yōu)化條件下產(chǎn)生的GAD粗酶液,分別采用p H為6濃度為60%和70%的硫酸銨鹽沉淀32 h時效果最好;然后,采用80 k D透析膜進行透析純化,若500 m L料液則膜處理時間12~16 h,透析效果較好;再將透析液經(jīng)二乙氨基乙基(Diethyl Aminoethanol,DEAE)纖維素樹脂分離純化GAD蛋白,DEAE在p H為6.5時對GAD的靜態(tài)吸附的飽和吸附量可達2.838 mg·g-1;在p H=7.5時采用0.4 mol·L-1 Na Cl溶液進行洗脫,洗脫液再利用G-75和G-100葡聚糖凝膠純化GAD蛋白樣品,蛋白質(zhì)含量為59.3%,最大吸收波長為225 nm。采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺電泳分離得到蛋白樣品條帶belt1,采用MALDI-TOF-TOF-MS技術(shù)對belt1蛋白條帶進行結(jié)構(gòu)表征,結(jié)果表明belt1蛋白分子質(zhì)量45.62 k D,等電點5.19,與已知蛋白質(zhì)gi/334732950匹配度為53,說明兩者具有相似性,但匹配到的序列組僅占蛋白全序列的3%,因此初步推測蛋白質(zhì)gi/334732950可能是belt1蛋白帶的一個主要的肽段,GAD可能是一種新的酶。論文初步研究了GAD的酶專一性和酶活性質(zhì),結(jié)果表明,GAD對沒食子酸具有較強的專一性,能夠較為專一的降解沒食子酸。選擇GAD含量為5 mg·m L-1,沒食子酸濃度為0.4 mg·m L-1,發(fā)酵溫度為35℃,磷酸鹽緩沖溶液的p H為6.0時對GAD酶活力的促進作用最強,而金屬離子對酶活力的促進作用強弱為Mg2+Sn2+Cu2+Zn2+K+Ca2+Fe2+,添加劑對酶活力的抑制作用強弱為EDTASDSTriton X-100Tween 20。
【學位授予單位】：中國林業(yè)科學研究院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：O629.8

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本文編號：1190034