本文關(guān)鍵詞：藍光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NgAUREO1對釀酒酵母細胞大小調(diào)控機理及轉(zhuǎn)基因酵母發(fā)酵能力的初步研究

  更多相關(guān)文章： 轉(zhuǎn)錄因子 AUREOs 細胞周期相關(guān)基因 酵母發(fā)酵能力

【摘要】：轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠識別基因啟動子區(qū)的順式作用元件并與之特異性地結(jié)合,對基因轉(zhuǎn)錄有激活或抑制效應(yīng)的蛋白質(zhì)分子,從分子水平上調(diào)控生物體的多種生理活動。目前對轉(zhuǎn)錄因子的研究多集中在陸生生物中,水生生物研究的較少,尤其是海洋微生物。2007年,日本工作者從海洋不等鞭毛藻類—無隔藻屬中發(fā)現(xiàn)了一類新型轉(zhuǎn)錄因子,受到外界環(huán)境中藍光的調(diào)控,命名為aureochromes (AUREOs),其由發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能的bZIP結(jié)構(gòu)域和接受藍光信號的LOV結(jié)構(gòu)域組成。藍光照射能夠使LOV構(gòu)象發(fā)生變化隨后引起bZIP構(gòu)象的變化,從而調(diào)控bZIP結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合的緊密性,影響基因的表達。目前已從海帶、海鏈藻、長囊水云、金藻等多種海洋藻類中發(fā)現(xiàn)了該轉(zhuǎn)錄因子,但對其功能了解較少。本文從微擬球藻(Nannochloropsis gaditana)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得了編碼另-AUREO的部分基因序列,命名為NgAUREOl。經(jīng)RACE擴增獲得其全長為2086bp,其中包括162bp的5’端非編碼區(qū)、490bp的3’端非編碼區(qū)以及1434bp的編碼區(qū),并成功導(dǎo)入了釀酒酵母細胞進行真核表達。獲得的陽性克隆在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與野生酵母細胞相比,重組酵母細胞變大；利用流式細胞儀分析重組酵母細胞中平均DNA和蛋白含量,結(jié)果表明,重組酵母中平均DNA含量由16提高到18.3、平均蛋白含量由3.75提高到6.28,進一步說明重組酵母細胞體積發(fā)生了明顯變化。從影響酵母細胞大小的重要方面—細胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)入手,分析NgAUREOl對酵母細胞大小的作用機理,根據(jù)AUREO識別并結(jié)合DNA核心序列(TGACGT)的特點,篩選了6個與細胞周期相關(guān)的基因(Pho85,Pho80, Pahl, Hspl2, Ies5和Bck2)。利用熒光定量PCR技術(shù)分析基因表達情況,經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),有4個基因表達發(fā)生了顯著變化,其中Pho85, Pho80和Pahl的表達量提高、Bck2表達量降低。因此,我們推斷NgAUREOl可能通過調(diào)節(jié)細胞周期進程影響細胞大小。另外。本實驗還對重組釀酒酵母的發(fā)酵能力進行了初步研究,對發(fā)酵48h的重組酵母和野生酵母的產(chǎn)乙醇能力進行測定,結(jié)果表明重組酵母具有較高的產(chǎn)乙醇能力,乙醇產(chǎn)量由野生酵母的9.68%增加到11.59%(v/v)。對重組酵母的發(fā)酵條件以及重要營養(yǎng)因子進行了優(yōu)化,獲得重組酵母以葡萄糖作為碳源,蛋白胨+酵母粉(質(zhì)量比1：2)作為混合氮源以及在初始pH值6.0、接種量6%、培養(yǎng)溫度30。C、轉(zhuǎn)速220 r/min等條件下最適于生長。本研究加深了對AUREOs的功能性認識,為AUREOs應(yīng)用于基因改造,實現(xiàn)外界光調(diào)理生物體內(nèi)基因表達奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)錄因子 AUREOs 細胞周期相關(guān)基因 酵母發(fā)酵能力
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TS261.1;Q93
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 文獻綜述13-34
• 1 轉(zhuǎn)錄因子13-20
• 1.1 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)13-15
• 1.2 轉(zhuǎn)錄因子的分類及相關(guān)功能15
• 1.3 轉(zhuǎn)錄因子在基因工程中的應(yīng)用15-16
• 1.4 人工轉(zhuǎn)錄因子16-17
• 1.5 轉(zhuǎn)錄因子研究方法17-20
• 1.5.1 研究轉(zhuǎn)錄因子功能的方法17-18
• 1.5.2 研究轉(zhuǎn)錄因子與DNA相關(guān)作用的方法18-20
• 1.5.3 轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)研究方法20
• 2 藍光調(diào)控性轉(zhuǎn)錄因子Aureochromes(AUREOs)20-24
• 2.1 AUREOs的結(jié)構(gòu)特點21-22
• 2.2 AUREOs的功能特點22-23
• 2.3 AUREOs潛在應(yīng)用—光遺傳學(xué)23-24
• 3 細胞大小調(diào)控因素—細胞周期24-27
• 3.1 酵母細胞周期中兩關(guān)鍵檢測點的作用機制25
• 3.2 周期蛋白依賴激酶(CDKs)活性調(diào)節(jié)25-26
• 3.3 細胞周期網(wǎng)絡(luò)對酵母細胞大小調(diào)控的分子機理26-27
• 4 生物質(zhì)能乙醇的研究現(xiàn)狀27-32
• 4.1 高性能發(fā)酵酵母的選育與改造28-30
• 4.1.1 自然篩選與適應(yīng)性進化28
• 4.1.2 誘變育種28-29
• 4.1.3 原生質(zhì)體融合與雜交29
• 4.1.4 代謝工程技術(shù)29-30
• 4.2 酵母發(fā)酵技術(shù)及工藝30-32
• 4.2.1 同步糖化發(fā)酵31
• 4.2.2 固定化發(fā)酵31-32
• 5 本課題立項依據(jù)及研究內(nèi)容32-34
• 第二章 微擬球藻NgAUREO1基因的克隆及真核表達34-48
• 1 材料與方法34-42
• 1.1 材料34-35
• 1.1.1 藻種34
• 1.1.2 載體與宿主34
• 1.1.3 主要試劑及試劑盒34
• 1.1.4 主要儀器設(shè)備34-35
• 1.1.5 培養(yǎng)基35
• 1.1.6 所用引物序列見表135
• 1.2 方法35-42
• 1.2.1 微擬球藻的培養(yǎng)與收集35-36
• 1.2.2 微擬球藻總RNA提取與質(zhì)量檢測36-37
• 1.2.3 cDNA第一條鏈的合成37
• 1.2.4 RACE技術(shù)擴增微擬球藻NgAUERO1全基因序列37-38
• 1.2.5 NgAUREO1開放閱讀框(ORF)序列的克隆38
• 1.2.6 目的片段的連接和轉(zhuǎn)化38-39
• 1.2.7 重組表達載體的構(gòu)建39-41
• 1.2.8 微擬球藻NgAUERO1基因的真核表達41-42
• 2 結(jié)果與討論42-47
• 2.1 微擬球藻總RNA質(zhì)量檢測42-43
• 2.2 微擬球藻NgAUERO1全序列獲得43-45
• 2.3 重組表達載體pAUR123-AUREO1的構(gòu)建45-46
• 2.4 真核表達微擬球藻NgAUERO1基因46-47
• 3 小結(jié)47-48
• 第三章 NgAUREO1調(diào)控釀酒酵母細胞大小機理研究48-59
• 1 材料與方法48-51
• 1.1 材料48-49
• 1.1.1 實驗材料48
• 1.1.2 主要試劑及儀器48-49
• 1.1.3 所用引物序列見表149
• 1.2 方法49-51
• 1.2.1 酵母細胞形態(tài)觀察與生長曲線的建立49-50
• 1.2.2 流式細胞儀分析酵母細胞DNA和蛋白含量的測定50
• 1.2.3 NgAUREO1基因在酵母中的表達50
• 1.2.4 轉(zhuǎn)基因酵母中細胞周期相關(guān)基因的表達分析50-51
• 1.2.5 藍光實驗51
• 2 結(jié)果與討論51-58
• 2.1 轉(zhuǎn)基因釀酒酵母細胞的基本特征51-53
• 2.2 流式細胞儀分析細胞DNA和蛋白含量53-54
• 2.3 NgAUREO1和細胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達分析54-57
• 2.4 藍光對轉(zhuǎn)NgAUREO1酵母細胞的細胞周期相關(guān)基因的影響57-58
• 3 小結(jié)58-59
• 第四章 轉(zhuǎn)基因酵母發(fā)酵能力初步研究59-69
• 1 材料與方法59-63
• 1.1 材料59-60
• 1.1.1 實驗材料59
• 1.1.2 主要試劑59
• 1.1.3 主要儀器設(shè)備59
• 1.1.4 培養(yǎng)基59-60
• 1.2 方法60-63
• 1.2.1 重鉻酸鉀溶液和DNS試劑以及標準品的配制60
• 1.2.2 標準曲線的建立60-62
• 1.2.3 轉(zhuǎn)基因酵母與野生酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力測定62
• 1.2.4 轉(zhuǎn)基因酵母培養(yǎng)條件的單因素試驗62-63
• 1.2.5 轉(zhuǎn)基因酵母培養(yǎng)基中碳源和氮源的優(yōu)化63
• 2 結(jié)果與討論63-68
• 2.1 轉(zhuǎn)基因酵母與野生酵母發(fā)酵能力63
• 2.2 轉(zhuǎn)基因酵母發(fā)酵條件的優(yōu)化63-67
• 2.2.1 接種量的優(yōu)化63-64
• 2.2.2 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化64-65
• 2.2.3 初始pH的優(yōu)化65
• 2.2.4 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的優(yōu)化65-66
• 2.2.5 培養(yǎng)時間的優(yōu)化66-67
• 2.3 轉(zhuǎn)基因酵母營養(yǎng)因子的優(yōu)化67-68
• 3 小結(jié)68-69
• 全文總結(jié)69-71
• 參考文獻71-78
• 致謝78-79
• 個人簡歷79
• 碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果79

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