發(fā)布時間：2017-09-11 04:15

  本文關(guān)鍵詞：一株耐酒精纖維素酶產(chǎn)生菌的選育及纖維素內(nèi)切酶組份研究

  更多相關(guān)文章： 纖維素內(nèi)切酶 篩選 發(fā)酵 酒精 芽孢桿菌

【摘要】：本文利用乙醇-CMC-Na平板進(jìn)行初篩,從不同材料中篩選產(chǎn)耐酒精纖維素酶的菌株。經(jīng)過搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,對產(chǎn)酶較高的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化測定及16S rDNA基因序列的同源性分析,獲得一株產(chǎn)酶穩(wěn)定的枯草芽孢桿菌Lys-1249。經(jīng)產(chǎn)酶條件的正交優(yōu)化,菌株及其所產(chǎn)的纖維素酶耐受酒精程度分析,菌株纖維素酶酶系的組成分析,并將該菌株纖維素內(nèi)切酶組分經(jīng)胰蛋白酶酶切,其片段的一級質(zhì)譜信息經(jīng)swissprot數(shù)據(jù)庫鑒定,對與數(shù)據(jù)庫中匹配較好的片段進(jìn)一步進(jìn)行二級質(zhì)譜鑒定；同時對菌株纖維素酶系相關(guān)信息與Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比較分析。本文得出如下主要結(jié)論：1、通過產(chǎn)酶條件優(yōu)化,表明菌株Lys-1249在麩皮2.0%,蛋白胨0.6%,K2HPO40.1%, MgSO4·7H2O 0.05%, FeSO4·7H2O 0.02%, MnSO40.01%,培養(yǎng)基初始pH 7.0,培養(yǎng)溫度37℃,發(fā)酵周期48h條件下,其耐酒精纖維素酶活力達(dá)到158.54U/mL。該菌株在6.0%乙醇培養(yǎng)基中生長良好；該菌株纖維素酶在乙醇6.0%-CMC-Na 1.0%的底物中活性保持65.95%。2、纖維素酶通過活性電泳分離純化后,將活性膠平鋪CMC-Na平板,可以通過檢測水解底物透明條帶,從而建立一種鑒別該纖維素酶酶系的組分可行方法,該方法具有直觀(直接觀察水解透明條帶),靈敏(可以檢測到0.1-0.2μg/mL內(nèi)切酶蛋白含量)的特點(diǎn)。通過該方法,發(fā)現(xiàn)菌株Lys-1249有3個內(nèi)切酶組分,分別為p1, p2, p3, 三者均只有一種亞基,其中p1的分子量為65.1Ku, p2的分子量為43.7Ku,p3的分子量為48.0Ku。菌株Lys-1249內(nèi)切酶組分p1, p2, p3經(jīng)胰蛋白酶酶切,其片段的一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜信息經(jīng)swissprot數(shù)據(jù)庫鑒定分析,同時在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)菌株Lys-1249內(nèi)切酶組分p 1, p2與Bacillus subtilis (strain 168) Glucose-6-phosphate isomerase匹配性好,采用打分法分析相似度具有顯著性。未發(fā)現(xiàn)與Lys-1249內(nèi)切酶組分p3匹配性好菌株相關(guān)蛋白信息。
【關(guān)鍵詞】：纖維素內(nèi)切酶 篩選 發(fā)酵 酒精 芽孢桿菌
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q93
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 第一章 緒論11-22
• 1.1 纖維素概述11-12
• 1.1.1 纖維素簡介11
• 1.1.2 纖維素的應(yīng)用11-12
• 1.2 纖維素酶概述12-16
• 1.2.1 纖維素酶分類12-13
• 1.2.2 纖維素酶的來源13-14
• 1.2.3 纖維素酶應(yīng)用14-16
• 1.2.4 纖維素酶與生物能源16
• 1.3 酒精生產(chǎn)16-18
• 1.3.1 發(fā)酵酒精及其耐酒精微生物研究現(xiàn)狀16-17
• 1.3.2 酒精生產(chǎn)工藝17-18
• 1.3.3 燃料酒精18
• 1.4 纖維生物質(zhì)與燃料乙醇18-19
• 1.5 耐酒精纖維素酶19-20
• 1.6 本實(shí)驗(yàn)研究的目的和意義20-21
• 1.7 本實(shí)驗(yàn)研究的內(nèi)容21-22
• 1.7.1 耐酒精纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定21
• 1.7.2 耐酒精纖維素酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)纖維素酶條件研究21
• 1.7.3 耐酒精纖維素酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)纖維素內(nèi)切酶組份研究21-22
• 第二章 耐酒精纖維素酶及其生產(chǎn)菌的篩選、鑒定22-33
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料的采集22
• 2.1.2 培養(yǎng)基22-23
• 2.1.3 主要試劑23
• 2.1.4 主要儀器23
• 2.2 方法23-25
• 2.2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩23-24
• 2.2.2 產(chǎn)纖維素酶菌株的搖瓶發(fā)酵復(fù)篩24
• 2.2.3 耐酒精纖維素酶活力的測定24-25
• 2.2.4 菌株形態(tài)、培養(yǎng)和生理生化鑒定25
• 2.2.5 菌株16S rDNA鑒定及分析25
• 2.2.6 菌株Lys-1249耐酒精性能分析25
• 2.2.7 菌株Lys-1249纖維素酶耐酒精性能分析25
• 2.3 結(jié)果與分析25-32
• 2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果25-26
• 2.3.2 耐酒精纖維素酶產(chǎn)生菌篩選結(jié)果26-27
• 2.3.3 耐酒精纖維素酶產(chǎn)生菌搖瓶復(fù)篩結(jié)果27-28
• 2.3.4 菌株Lys-1249形態(tài)和生理生化特征28-30
• 2.3.5 菌株Lys-1249 16s RNA測序鑒定30
• 2.3.6 菌株Lys-1249耐酒精性能分析30-31
• 2.3.7 菌株Lys-1249纖維素酶耐酒性能分析31-32
• 2.4 小結(jié)32-33
• 2.4.1 耐酒精纖維素酶產(chǎn)生菌平板篩選方法32
• 2.4.2 耐酒精纖維素酶產(chǎn)生菌及其酶耐酒精性能32
• 2.4.3 耐酒精纖維素酶檢測方法32-33
• 第三章 耐酒精纖維素酶生產(chǎn)菌的Lys-1249產(chǎn)酶條件的優(yōu)化33-44
• 3.1 材料33-34
• 3.1.1 菌株Lys-124933
• 3.1.2 基本發(fā)酵培養(yǎng)基33
• 3.1.3 主要試劑33-34
• 3.2 方法34-35
• 3.2.1 發(fā)酵溫度對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響34
• 3.2.2 碳源對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響34
• 3.2.3 麩皮對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響34
• 3.2.4 氮源對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響34
• 3.2.5 蛋白胨對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響34
• 3.2.6 培養(yǎng)基起始pH值對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響34
• 3.2.7 接種量對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響34-35
• 3.2.8 培養(yǎng)基裝液量對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響35
• 3.2.9 搖床轉(zhuǎn)速對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響35
• 3.2.10 發(fā)酵周期對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響35
• 3.2.11 正交試驗(yàn)優(yōu)化菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶的條件35
• 3.3 結(jié)果與分析35-43
• 3.3.1 發(fā)酵溫度對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響35-36
• 3.3.2 碳源對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響36
• 3.3.3 麩皮對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響36-37
• 3.3.4 氮源對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響37
• 3.3.5 蛋白胨對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響37-38
• 3.3.6 培養(yǎng)基起始pH值對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響38-39
• 3.3.7 接種量對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響39
• 3.3.8 培養(yǎng)基裝液量對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響39-40
• 3.3.9 搖床轉(zhuǎn)速對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響40
• 3.3.10 發(fā)酵周期對菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶影響40-41
• 3.3.11 正交試驗(yàn)優(yōu)化菌株Lys-1249產(chǎn)纖維素酶的條件41-43
• 3.4 小結(jié)43-44
• 第四章 枯草芽孢桿菌Lys-1249的耐酒精纖維素內(nèi)切酶組份研究44-53
• 4.1 材料44
• 4.1.1 菌株Lys-124944
• 4.1.2 主要試劑44
• 4.2 方法44-47
• 4.2.1 纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件44-45
• 4.2.2 測定耐酒精纖維素酶活力45
• 4.2.3 菌株Lys-1249纖維素酶的制備45
• 4.2.4 纖維素酶的硫酸銨濃縮45
• 4.2.5 耐酒精纖維素酶系活性電泳及平板催化分析45
• 4.2.6 耐酒精纖維素酶系組分活性電泳純化45
• 4.2.7 纖維素酶系組分的亞基分子量測定45-46
• 4.2.8 菌株Lys-1249纖維素酶系組份的質(zhì)譜鑒定分析46-47
• 4.3 結(jié)果與分析47-52
• 4.3.1 耐酒精纖維素酶系活性電泳劑平板催化分析47-48
• 4.3.2 耐酒精纖維素酶組分亞基分子量的測定48
• 4.3.3 耐酒精纖維素酶組分二級質(zhì)譜分析的測定48-52
• 4.4 小結(jié)52-53
• 第五章 結(jié)論53-55
• 5.1 實(shí)驗(yàn)研究性結(jié)論53-54
• 5.2 論文研究的不足與下一步研究方向54
• 5.3 創(chuàng)新點(diǎn)54-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 致謝61

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