本文關(guān)鍵詞：擬南芥IAA1的原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白質(zhì)表達(dá)與純化

  更多相關(guān)文章： 擬南芥 生長素抑制蛋白 重組蛋白 原核表達(dá) 蛋白純化

【摘要】：植物激素是植物體內(nèi)合成的一系列微量有機(jī)化合物,對植物的生長發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答具有重要的作用,植物激素在植物體內(nèi)含量極低,易分解和氧化,其超微定量是制約植物激素研究的瓶頸之一,利用植物激素信號途徑中能與之高親和結(jié)合的響應(yīng)因子創(chuàng)建某一激素的特異分離純化方法可能是解決該問題的有效途徑。因此,本研究從擬南芥獲得生長素抑制蛋白基因IAA1的編碼序列,以pGEX-KG為基本骨架構(gòu)建IAA1原核表達(dá)載體,優(yōu)化IAA1在三種大腸桿菌中表達(dá)條件,獲得大量的IAA1重組蛋白為構(gòu)建一種高效的生長素分離純化方法奠定基礎(chǔ)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下：(1)獲得了IAA1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。以野生擬南芥為材料,提取擬南芥總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)GeneBan數(shù)據(jù)庫中公布的IAAlcDNA序列設(shè)計(jì)引物,以cDNA為模板,獲得IAA1基因片段。(2)構(gòu)建了IAA1原核表達(dá)載體。將IAAl基因與T載體連接,經(jīng)過質(zhì)粒PCR鑒定和雙酶切鑒定篩選出陽性克隆,結(jié)果測序比對,確認(rèn)獲得正確的IAA1基因。連接質(zhì)粒pGEX-KG后,轉(zhuǎn)入DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)過質(zhì)粒PCR鑒定和雙酶切鑒定篩選出陽性重組子。(3)確定了IAA1蛋白質(zhì)的最佳表達(dá)菌株。將構(gòu)建好的pGEX-KG-IAA1重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入三種不同的表達(dá)菌株細(xì)胞中,加入異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果表明,Rosetta (DE3)為IAA1蛋白質(zhì)的最佳表達(dá)菌株。(4)確定了IAA1蛋白最佳誘導(dǎo)溫度。設(shè)定不同誘導(dǎo)溫度對不同誘導(dǎo)溫度條件下的總量樣、上清樣和結(jié)合樣進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析,結(jié)果表明,IAA1蛋白的最佳誘導(dǎo)溫度為25℃。(5)獲得了IAA1蛋白最佳誘導(dǎo)劑濃度。結(jié)果表明,IAA1蛋白的最佳誘導(dǎo)劑濃度為06mmol/L。
【關(guān)鍵詞】：擬南芥 生長素抑制蛋白 重組蛋白 原核表達(dá) 蛋白純化
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1 緒論9-16
• 1.1 研究背景和意義9-10
• 1.2 國內(nèi)外研究進(jìn)展10-15
• 1.2.1 生長素及其調(diào)控的分子機(jī)理10-12
• 1.2.2 能與生長素結(jié)合的蛋白12-13
• 1.2.3 生長素抑制蛋白Aux/IAA13-14
• 1.2.4 蛋白質(zhì)的重組表達(dá)14-15
• 1.3 本研究的總體思路15-16
• 2 材料與方法16-26
• 2.1 材料16
• 2.1.1 植物材料16
• 2.1.2 質(zhì)粒和菌株16
• 2.1.3 主要試劑16
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備16
• 2.2 試驗(yàn)方法16-26
• 2.2.1 生物信息學(xué)分析16-17
• 2.2.2 IAA1基因的克隆17-20
• 2.2.3 擬南芥IAA1原核表達(dá)載體的構(gòu)建20-23
• 2.2.4 IAA1蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)23-26
• 3 結(jié)果與分析26-41
• 3.1 生物信息學(xué)分析26-29
• 3.1.1 IAA蛋白的基本性質(zhì)26-27
• 3.1.2 IAA蛋白的疏水性27
• 3.1.3 IAA1蛋白的信號肽分析27-28
• 3.1.4 IAA蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測28-29
• 3.2 IAA1的原核表達(dá)載體構(gòu)建29-32
• 3.2.1 擬南芥總RNA的提取及IAA1基因的擴(kuò)增29-30
• 3.2.2 IAA1基因T載體克隆的酶切鑒定30-31
• 3.2.3 原核表達(dá)載體pGEX-KG的酶切鑒31-32
• 3.3 IAA1蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化32-41
• 3.3.1 IAA在不同菌株中的表達(dá)32-35
• 3.3.2 最佳誘導(dǎo)溫度的確定35-37
• 3.3.3 最佳誘導(dǎo)劑濃度的確定37-41
• 4 討論41-43
• 全文總結(jié)及后續(xù)研究設(shè)想43-45
• 參考文獻(xiàn)45-51
• 致謝51-52
• 作者簡歷52

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李光玉,黃長形,潘蕾,牟丹蕾,李新紅,張穎,楊為松,白雪帆;漢灘病毒核蛋白羧基端多肽原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J];中國病毒學(xué);2003年05期

2 何煒;章茜;張朝;趙國強(qiáng);;重組原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-MAGE-1的構(gòu)建及表達(dá)[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2006年03期

3 孫勇;孫曙光;吳煒;張勇;呂尚軍;王林;彭曦;汪仕良;;人解痙多肽原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2008年12期

4 鄭少江;黃鳳迎;鄭少萍;王偉;吳人亮;;雞成纖維細(xì)胞生長因子Ⅰ型受體胞外段原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)鑒定[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2006年04期

5 馬輝;趙緒永;;大鼠熱休克因子結(jié)合蛋白1原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J];鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校學(xué)報;2007年04期

6 李朝輝;田長富;;重組L-蛋氨酸γ-裂解酶基因原核表達(dá)載體構(gòu)建及初步鑒定(摘要)[J];昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2009年06期

7 周娟;趙瑞強(qiáng);陳莉;吳耀生;;三七法呢基焦磷酸合酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)[J];生物技術(shù)通報;2009年09期

8 鄔玉蘭;劉志剛;陳小文;;奶牛主要過敏原β-乳球蛋白基因的克隆及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2009年09期

9 楊震;楊可;侯曼美;景麗麗;張睿;張麗;雷寒;何通川;周建中;;人組織型纖溶酶原激活劑原核表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的初步表達(dá)[J];西南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2012年04期

10 鄧健蓓,陳萍,王字玲,陳常慶,蘇成芝;帶有蛋白標(biāo)簽的原核表達(dá)載體構(gòu)建[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1998年03期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鄔玉蘭;劉志剛;;牛奶主要過敏原β-乳球蛋白基因的克隆及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建[A];中華醫(yī)學(xué)會2009年全國變態(tài)反應(yīng)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

2 劉全華;華麗;霍婧;鮑一笑;;人白介素13原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)[A];第六屆江浙滬兒科學(xué)術(shù)會議暨兒科學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展學(xué)術(shù)班論文匯編[C];2009年

3 劉林林;王鐵君;楊艷明;蘇清秀;殷勝松;張奇;龔守良;;小鼠分泌型內(nèi)皮抑素原核表達(dá)載體pNZ44-ssEndostatin的構(gòu)建及表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會放射腫瘤治療學(xué)分會六屆二次暨中國抗癌協(xié)會腫瘤放療專業(yè)委員會二屆二次學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

4 楊海杰;管寶全;羅文新;李少偉;鮮陽凌;張軍;夏寧邵;;含分泌信號的原核表達(dá)載體的組建及應(yīng)用[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第八屆會員代表大會暨全國學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2001年

5 彭旭;袁順宗;王曉娟;甘成軍;王慶紅;陳烯偉;張小容;胡曉紅;羅高興;吳軍;;人HT036蛋白的原核表達(dá)及鑒定[A];第八屆全國燒傷外科學(xué)年會論文匯編[C];2007年

6 李慎濤;歐陽紅生;張玉靜;張銳;廖曉萍;孫博興;張永亮;;豬肌生成抑制素基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)[A];新世紀(jì) 新機(jī)遇 新挑戰(zhàn)——知識創(chuàng)新和高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展（上冊）[C];2001年

7 李慎濤;歐陽紅生;張玉靜;張銳;廖曉萍;孫博興;張永亮;;豬肌生成抑制素基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第八屆會員代表大會暨全國學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2001年

8 徐海燕;徐志偉;;人胰島素樣生長因子-1的原核表達(dá)載體的構(gòu)建[A];山東免疫學(xué)會、山東微生物學(xué)會醫(yī)學(xué)微生物學(xué)專業(yè)委員會、山東省醫(yī)學(xué)會微生物學(xué)和免疫學(xué)專業(yè)委員會、山東省醫(yī)藥生物技術(shù)學(xué)會2001年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2001年

9 李士澤;張艷宇;張玉靜;;凋亡蛋白融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及序列分析[A];動物生理生化學(xué)分會第八次學(xué)術(shù)會議暨全國反芻動物營養(yǎng)生理生化第三次學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2004年

10 鮑德明;胡乃中;沈際佳;石海;許建明;;人巨噬細(xì)胞金屬彈力酶催化域基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國消化病學(xué)術(shù)會議論文匯編（下冊）[C];2007年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 遲吉娜;棉纖維發(fā)育相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

2 劉芳;1.Keap1和p65蛋白相互作用及其作用機(jī)制研究 2.Mayven不同截短體原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)和純化[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2008年

3 王桂武;重組IGFBP-4蛋白的表達(dá)、純化、晶體生長及其對鹿茸細(xì)胞增殖抑制的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 海旭南;瑟氏泰勒蟲p33基恩與牛IL-18基的串聯(lián)表達(dá)[D];延邊大學(xué);2015年

2 謝偉民;擬南芥IAA1的原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白質(zhì)表達(dá)與純化[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 楊震;人組織型纖溶酶原激活劑原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的初步表達(dá)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

4 李曉華;重組梅花鹿胸腺素β_4原核表達(dá)載體的構(gòu)建及活性研究[D];長春中醫(yī)藥大學(xué);2013年

5 范海鳴;大鼠寡霉素敏感相關(guān)蛋白的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

6 王喜;重組人糖皮質(zhì)激素受體原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

7 徐珍珍;人膠原蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

8 詹輝;改良型TAT-PTD-VP3融合蛋白的基因合成、原核表達(dá)載體構(gòu)建及原核表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2006年

9 張?jiān)讫?一種蛋白內(nèi)含子介導(dǎo)純化的原核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2004年

10 畢城偉;Kringle5基因克隆、原核表達(dá)載體構(gòu)建和蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2009年

，

本文編號：793297