本文關(guān)鍵詞：綠藻遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及轉(zhuǎn)DR5：：GFP小球藻的熒光分析

  更多相關(guān)文章： 轉(zhuǎn)化 單細(xì)胞 DR5::GFP 綠藻 生長(zhǎng)素

【摘要】：單細(xì)胞綠藻是植物分子生物學(xué)研究的良好材料,其電擊轉(zhuǎn)化因操作簡(jiǎn)單、成本低等特點(diǎn)倍受研究者的青睞。但傳統(tǒng)的藻類電擊轉(zhuǎn)化方法中,必須使用較強(qiáng)電場(chǎng)和較長(zhǎng)電擊時(shí)間才能保證外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi),這帶來的負(fù)面效果就是增加細(xì)胞的致死率從而降低電擊轉(zhuǎn)化效率。本研究通過探索不同電擊條件轉(zhuǎn)化單細(xì)胞綠藻,優(yōu)化了綠藻轉(zhuǎn)化體系,旨在提高藻類的電擊轉(zhuǎn)化效率,為小球藻和萊茵衣藻的進(jìn)一步利用奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。DR5是生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的生物活性很強(qiáng)且特異性很高的啟動(dòng)子,結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察,DR5::GFP能夠直觀且靈敏地反映細(xì)胞和組織水平的生長(zhǎng)素活性強(qiáng)弱。本研究將DR5::GFP轉(zhuǎn)入到單細(xì)胞小球藻中,并對(duì)其進(jìn)行了熒光分析,旨在利用轉(zhuǎn)DR5::GFP綠藻為探針細(xì)胞實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平IAA測(cè)定提供良好的前期基礎(chǔ)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下：(1)建立了綠藻單細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系,得到了電擊最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件。確定了小球藻和萊茵衣藻轉(zhuǎn)化子篩選的潮霉素濃度分別為25 mg/L和100 mg/L,以及小球藻轉(zhuǎn)化子篩選的卡那霉素濃度為100 mg/L。獲得了綠藻原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化的最佳電場(chǎng)強(qiáng)度,小球藻和萊茵衣藻的原生質(zhì)體最佳電擊場(chǎng)強(qiáng)分別為0.8 KV/cm和0.6 KV/crn。獲得了原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化最佳脈沖時(shí)間,確定小球藻和萊茵衣藻的最佳脈沖時(shí)間均為10 ms。發(fā)現(xiàn)制備原生質(zhì)體和2-DG處理能明顯提高綠藻電擊轉(zhuǎn)化效率。(2)得到了轉(zhuǎn)DR5：：GFP小球藻。通過制備原生質(zhì)體和2-DG處理并在0.8KV/cm、脈沖時(shí)間為10 ms的電擊條件下,得到了轉(zhuǎn)DR5::GFP小球藻。(3)獲得了適宜誘導(dǎo)GFP表達(dá)的IAA濃度。通過不同濃度IAA處理轉(zhuǎn)DR5::GFP小球藻,經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光,發(fā)現(xiàn)在IAA終濃度為4μg/mL、5μg/mL時(shí)其熒光明顯。(4)得到了轉(zhuǎn)DR5::GFP小球藻低溫保存的較佳條件。通過對(duì)不同冷凍溫度、不同冷凍保護(hù)劑處理的小球藻進(jìn)行冷凍保存,解凍7天后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)小球藻最優(yōu)的保存溫度為-70℃,冷凍保護(hù)劑為10%DMSO+10%蔗糖,其解凍存活率最高,達(dá)34.68%。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)化 單細(xì)胞 DR5::GFP 綠藻 生長(zhǎng)素
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q949.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 第1章 緒論8-12
• 1.1 研究背景8-11
• 1.1.1 生長(zhǎng)素測(cè)定方法的研究8-9
• 1.1.2 綠藻的分子生物學(xué)特性9-10
• 1.1.3 藻類轉(zhuǎn)化方法的研究10-11
• 1.2 研究目的與意義11
• 1.3 研究技術(shù)路線11-12
• 第2章 綠藻轉(zhuǎn)化體系的建立12-24
• 2.1 引言12
• 2.2 材料與方法12-18
• 2.2.1 試驗(yàn)材料12-14
• 2.2.2 試驗(yàn)方法14-18
• 2.3 結(jié)果與分析18-23
• 2.3.1 綠藻轉(zhuǎn)化中最適潮霉素篩選濃度的確定18-19
• 2.3.2 電擊轉(zhuǎn)化中最佳電場(chǎng)強(qiáng)度的確定19-20
• 2.3.3 電擊轉(zhuǎn)化中最佳脈沖時(shí)間的確定20
• 2.3.4 藻種狀態(tài)對(duì)電擊轉(zhuǎn)化的影響20-21
• 2.3.5 轉(zhuǎn)化綠藻分子檢測(cè)21-22
• 2.3.6 GUS組織化學(xué)染色22-23
• 2.4 小結(jié)與討論23-24
• 2.4.1 小球藻和萊茵衣藻遺傳轉(zhuǎn)化的篩選條件23
• 2.4.2 影響小球藻和萊茵衣藻轉(zhuǎn)化效率的因素23-24
• 第3章 DR5：：GFP轉(zhuǎn)化小球藻及熒光分析24-32
• 3.1 引言24
• 3.2 材料與方法24-26
• 3.2.1 試驗(yàn)材料24-25
• 3.2.2 試驗(yàn)方法25-26
• 3.3 結(jié)果與分析26-30
• 3.3.1 小球藻轉(zhuǎn)化中最適卡那霉素篩選濃度的確定26-27
• 3.3.2 轉(zhuǎn)化藻株的抗性篩選27
• 3.3.3 轉(zhuǎn)化藻株的PCR檢測(cè)27-28
• 3.3.4 IAA處理轉(zhuǎn)化藻株后熒光檢測(cè)GFP28-29
• 3.3.5 轉(zhuǎn)化藻株的RT-PCR檢測(cè)29-30
• 3.4 小結(jié)與討論30-32
• 3.4.1 獲得了轉(zhuǎn)DR5：：GFP野生型小球藻30-31
• 3.4.2 獲得了適宜誘導(dǎo)GFP表達(dá)的IAA濃度31-32
• 第4章 轉(zhuǎn)DR5：：GFP小球藻的低溫保存32-38
• 4.1 引言32
• 4.2 材料與方法32-34
• 4.2.1 試驗(yàn)材料32
• 4.2.2 試驗(yàn)方法32-34
• 4.3 結(jié)果與分析34-36
• 4.3.1 不同抗凍保護(hù)劑對(duì)轉(zhuǎn)DR5：：GFP小球藻-20℃冷凍保存的影響34
• 4.3.2 不同抗凍保護(hù)劑對(duì)轉(zhuǎn)DR5：：GFP小球藻-70℃冷凍保存的影響34-35
• 4.3.3 不同抗凍保護(hù)劑對(duì)轉(zhuǎn)DR5：：GFP小球藻-196℃冷凍保存的影響35
• 4.3.4 不同冷藏溫度對(duì)小球藻存活率的影響35-36
• 4.4 小結(jié)與討論36-38
• 4.4.1 不同抗凍保護(hù)劑對(duì)小球藻低溫冷藏的效果36-37
• 4.4.2 不同冷凍溫度對(duì)小球藻低溫冷藏的效果37-38
• 全文總結(jié)38-40
• 1 本研究試驗(yàn)結(jié)果38
• 1.1 建立了綠藻轉(zhuǎn)化體系38
• 1.2 獲得了轉(zhuǎn)化DR5：GFP小球藻及誘導(dǎo)GFP表達(dá)的IAA濃度38
• 1.3 得到了轉(zhuǎn)DR5：GFP小球藻的低溫保存的較佳條件38
• 2 特色及創(chuàng)新點(diǎn)38-39
• 3 后續(xù)研究設(shè)想39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 致謝44-45
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷45

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王一葦;朱華鋒;孫秉中;陳協(xié)群;張濤;張傳山;;TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL的受體DR4、DR5 在急性非淋巴細(xì)胞白血病中的表達(dá)及臨床意義[A];第10屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2005年

2 馬遠(yuǎn)方;劉廣超;李淑蓮;杜耀武;張軍;白慧玲;都景芳;;抗人DR5抗體抗腫瘤作用及作用機(jī)制[A];第六屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 趙曉斐;抗腫瘤藥物調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中DR5表達(dá)的分子機(jī)制[D];山東大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 劉曉鵬;綠藻遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及轉(zhuǎn)DR5：：GFP小球藻的熒光分析[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 劉小華;DR5在阿司匹林誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制[D];河南大學(xué);2010年

3 郝振亮;~(131)I標(biāo)記DR5抗體zaptuzumab的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

，

本文編號(hào)：773946