本文關(guān)鍵詞：泡蘿卜中植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

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【摘要】：本文利用實(shí)驗(yàn)室前期從蘿卜泡菜中篩選出一株具有降解亞硝酸鹽能力的植物乳桿菌為研究材料,根據(jù)GenBank中亞硝酸鹽還原酶(nir)基因序列,利用生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)引物。提取植物乳桿菌的DNA,采用PCR技術(shù)擴(kuò)增亞硝酸鹽還原酶(nir)基因,TA克隆獲得重組質(zhì)粒pMD19-nir,分析亞硝酸鹽還原酶核苷酸序列的同源性。通過雙酶切連接到表達(dá)載體pET-32a(+)中,獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-nir,然后轉(zhuǎn)化至E.coli BL(DE3)。由于目的蛋白形成了包涵體,對(duì)其進(jìn)行純化,然后進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的初步分析,主要結(jié)論如下：(1)根據(jù)GenBank中Lactobacillus plantarum WCFS1全部基因序列,設(shè)計(jì)特異性引物。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增亞硝酸鹽還原酶(nir)基因,通過TA克隆獲得重組質(zhì)粒pMD19-nir。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測序,然后用軟件分析測序結(jié)果：亞硝酸鹽還原酶(nir)基因開放閱讀框(ORF)堿基的長度為1638bp,序列經(jīng)NCBI Blast比對(duì),與其它nir(JX434610-1)的最高同源性為99%。即成功克隆出亞硝酸鹽還原酶的基因。(2)雙酶切T克隆質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-32a(+),然后進(jìn)行連接反應(yīng),獲得重組表達(dá)載體pET-32a(+)-nir,將構(gòu)建成功的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.coli BL(DE3)中。重組表達(dá)菌株提取質(zhì)粒DNA后,經(jīng)PCR鑒定和雙酶切鑒定正確后。將重組表達(dá)菌株在IPTG誘導(dǎo)下,收集菌體,然后用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌,超聲波破碎后,取沉淀和上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。分析結(jié)果：重組蛋白存在于沉淀中,即形成的包涵體,其分子量大小為80kDa,即成功構(gòu)建了大腸桿菌的表達(dá)菌株并且經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)能產(chǎn)生目的蛋白。(3)由于重組目的蛋白形成了包涵體,需用8mol/L高濃度的尿素溶解包涵體,利用帶有6個(gè)his標(biāo)簽,進(jìn)行Ni2+柱親和層析純化,當(dāng)pH降到4.3,從Ni2＋柱中洗脫出目的蛋白,將目的蛋白溶液分別在4mol/L、2mol/L、0mol/L進(jìn)行尿素的梯度透析復(fù)性,然后將蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。對(duì)復(fù)性后的重組酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析,在不同pH值和溫度下測定亞硝酸鹽還原酶(nir)的酶活力。對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析：純化后蛋白中其雜蛋白明顯減少,從而提高了目的蛋白的含量。在不同溫度下酶活力的檢測,在20-35℃條件下,隨著溫度的增加,酶活力逐漸增加,在35℃達(dá)到最大值為72.39U/mL,然后隨著溫度的增加酶活力逐漸降低。在pH值5.5-8.0條件下,酶活力隨著pH值的增加呈現(xiàn)為先增加后降低,在pH值為7.5時(shí)達(dá)到最大值,即在35℃,pH值為7.5時(shí),測定重組酶的酶活最大值為101.99U/mL。酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)中Km為59.17mmol/L, Vm為166.67nmol/min·μL。即構(gòu)建的重組表達(dá)菌株經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的包涵體經(jīng)純化后,具有一定的酶活力。
【關(guān)鍵詞】：植物乳桿菌 亞硝酸鹽還原酶 克隆 基因表達(dá) 酶學(xué)性質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TS201.3
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮寫詞說明8-11
• 1 前言11-19
• 1.1 文獻(xiàn)綜述11-16
• 1.1.1 四川泡菜概述11-12
• 1.1.2 亞硝酸鹽的來源12
• 1.1.3 亞硝酸鹽的危害12-13
• 1.1.4 硝酸鹽降解方法的研究13-15
• 1.1.5 硝酸鹽還原酶的研究進(jìn)展15-16
• 1.2 研究目的和意義16-17
• 1.3 研究內(nèi)容與技術(shù)路線17-19
• 1.3.1 實(shí)驗(yàn)的研究內(nèi)容17-18
• 1.3.2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線18-19
• 2 材料與方法19-34
• 2.1 試驗(yàn)材料19-21
• 2.1.1 供試菌種及克隆載體19
• 2.1.2 主要試劑19
• 2.1.3 主要儀器19-20
• 2.1.4 試劑和培養(yǎng)基的配制20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-34
• 2.2.1 亞硝酸鹽還原酶基因的克隆21-27
• 2.2.2 亞硝酸鹽還原酶基因的原核表達(dá)27-29
• 2.2.3 重組酶的純化29-31
• 2.2.4 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究31-34
• 3 結(jié)果與分析34-44
• 3.1 亞硝酸鹽還原酶(nir)基因的克隆34-37
• 3.1.1 亞硝酸鹽還原酶(nir)基因的擴(kuò)增34
• 3.1.2 T克隆的PCR鑒定34-35
• 3.1.3 T克隆的雙酶切鑒定及序列比對(duì)結(jié)果35-37
• 3.2 亞硝酸鹽還原酶(nir)基因的表達(dá)37-40
• 3.2.1 重組質(zhì)粒pET-32a(+)-nir的PCR鑒定37-38
• 3.2.2 重組質(zhì)粒pET-32a-nir的雙酶切鑒定38-39
• 3.2.3 亞硝酸鹽還原酶在大腸桿菌中的表達(dá)39-40
• 3.3 重組酶的純化40-41
• 3.3.1 重組酶純化后的電泳檢測40-41
• 3.4 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果41-44
• 3.4.1 亞硝酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線41-42
• 3.4.2 不同溫度對(duì)重組酶酶活的影響42
• 3.4.3 不同pH值對(duì)重組酶酶活的影響42-43
• 3.4.4 Km值的測定43-44
• 4 討論44-47
• 4.1 亞硝酸鹽還原酶基因的克隆和表達(dá)44
• 4.2 包涵體的純化44-45
• 4.3 酶學(xué)性質(zhì)的分析45-46
• 4.4 酶活力的分析46-47
• 5 結(jié)論與展望47-49
• 5.1 結(jié)論47
• 5.2 展望47-49
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 致謝55-56
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文56-57
• 附錄57-58

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 龔鋼明;何婷婷;高能;;植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因在大腸桿菌中表達(dá)[J];中國釀造;2012年11期

2 ;[J];;年期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 董維;泡蘿卜中植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 趙欣欣;基于亞硝酸鹽還原酶酶學(xué)特性的優(yōu)勢菌除Cr（Ⅵ）機(jī)理研究[D];廣東工業(yè)大學(xué);2013年

3 孫美慧;鈾酰離子—細(xì)胞色素b_5相互作用/亞硝酸鹽—肌紅蛋白相互反應(yīng)研究[D];南華大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：715444