本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)多酚氧化酶茶葉內(nèi)生真菌的篩選及酶的分離純化

  更多相關(guān)文章： 內(nèi)生真菌 多酚氧化酶 菌株篩選 發(fā)酵優(yōu)化 分離純化 HPLC

【摘要】：多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, PPO)是一類銅蛋白,能有效地催化多酚類化合物氧化形成相應(yīng)的醌類物質(zhì),在含酚廢水處理、木質(zhì)素降解以及染料脫色等領(lǐng)域得到較好的研究和應(yīng)用,具有廣泛的應(yīng)用前景。茶葉細(xì)胞中富含多酚化合物和多酚氧化酶,在茶葉體內(nèi)生物合成和制茶過程中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化中起重要作用,是紅茶和黑茶風(fēng)味和特質(zhì)形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。本論文以分離自健康茶葉組織的內(nèi)生真菌為材料,篩選產(chǎn)多酚氧化酶的菌株,研究菌株的培養(yǎng)條件,分離純化多酚氧化酶,并應(yīng)用于茶多酚的生物轉(zhuǎn)化,為茶樹內(nèi)生真菌及其多酚氧化酶的利用打下基礎(chǔ)。利用平板顯色初篩和搖瓶復(fù)篩,從14株內(nèi)生真菌菌株篩選出相對(duì)高產(chǎn)多酚氧化酶的菌株CSN-13,通過HPLC檢測(cè)茶多酚溶液的變化,進(jìn)一步確定菌株CSN-13產(chǎn)多酚氧化酶的能力。通過形態(tài)學(xué)鑒定和真菌ITS序列分析,初步鑒定菌株CSN-13為茴麻鏈格孢(Alternaria abutilonis)。將菌株CSN-13作為出發(fā)菌株,利用單因素和響應(yīng)面法分別對(duì)液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后的酶活比優(yōu)化前分別提高了8.5倍和10倍。然后利用優(yōu)化后條件對(duì)菌株CSN-13進(jìn)行液體發(fā)酵,通過硫酸銨鹽析沉淀、DEAE-陰離子交換層析、葡聚糖G-150凝膠層析等方法進(jìn)行分離純化多酚氧化酶,將獲得的樣品通過SDS-PAGE凝膠電泳后,通過考馬斯亮藍(lán)R-250染色,顯示兩條清晰的蛋白條帶,相對(duì)分子量分別約為50 kDa和70 kDa。純化倍數(shù)為3.50倍,回收率為3.15%。對(duì)純化后的多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,最適溫度為30℃,最適pH為5.5。通過優(yōu)化后確定產(chǎn)茶樹多酚氧化酶的固體發(fā)酵培養(yǎng)基,然后將固體發(fā)酵后產(chǎn)物和純化后的多酚氧化酶加入到一定濃度的茶多酚溶液中進(jìn)行反應(yīng),通過HPLC檢測(cè),發(fā)現(xiàn)多酚物質(zhì)含量變化大且出現(xiàn)多個(gè)未知峰,表明固體發(fā)酵和液體發(fā)酵產(chǎn)酶均有生物轉(zhuǎn)化作用。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)生真菌 多酚氧化酶 菌株篩選 發(fā)酵優(yōu)化 分離純化 HPLC
【學(xué)位授予單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q936
【目錄】：

• 中文摘要2-3
• Abstract3-5
• 中文文摘5-12
• 第一章 緒論12-26
• 1 多酚氧化酶概述12-16
• 1.1 多酚氧化酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)12
• 1.2 多酚氧化酶的分布和分類12-13
• 1.3 多酚氧化酶的催化機(jī)理13-14
• 1.4 多酚氧化酶的提取技術(shù)14-15
• 1.5 多酚氧化酶活力的測(cè)定15-16
• 2 多酚氧化酶分離和酶學(xué)性質(zhì)16-19
• 2.1 多酚氧化酶分離純化的方法16-17
• 2.2 多酚氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)17-18
• 2.3 多酚氧化酶的同工酶18-19
• 3 多酚氧化酶的生理功能19-20
• 3.1 使高等植物組織發(fā)生褐變19
• 3.2 與植物抗病作用有關(guān)19
• 3.3 參與β-花青素的生物合成19
• 3.4 與綠色植物光合作用有關(guān)19
• 3.5 其他生理功能19-20
• 4 多酚氧化酶的應(yīng)用20-21
• 4.1 多酚氧化酶在食品領(lǐng)域的應(yīng)用20
• 4.2 多酚氧化酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用20-21
• 4.3 多酚氧化酶在的其他方面的應(yīng)用21
• 5 微生物多酚氧化酶應(yīng)用21
• 6 多酚氧化酶與茶多酚21-22
• 7 研究的主要內(nèi)容和意義22-26
• 7.1 本研究的主要內(nèi)容22-23
• 7.2 技術(shù)路線23-26
• 第二章 茶葉中產(chǎn)多酚氧化酶真菌的篩選和鑒定26-38
• 2.1 前言26
• 2.2 材料26-28
• 2.2.1 菌種26
• 2.2.2 主要藥品及設(shè)備26-27
• 2.2.3 培養(yǎng)基及試劑的配制27-28
• 2.3 方法28-30
• 2.3.1 茶葉內(nèi)生真菌菌的活化28
• 2.3.2 產(chǎn)多酚氧化酶內(nèi)生真菌菌株初篩28
• 2.3.3 液體發(fā)酵復(fù)篩28-29
• 2.3.4 菌株形態(tài)觀察29
• 2.3.5 基因組DNA的提取29
• 2.3.6 PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件29-30
• 2.3.7 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建30
• 2.4 結(jié)果與分析30-35
• 2.4.1 菌株的初篩30-31
• 2.4.2 液體發(fā)酵復(fù)篩31-33
• 2.4.3 CSN-13形態(tài)觀察33
• 2.4.4 菌株的ITS測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建33-35
• 2.5 小結(jié)與討論35-38
• 第三章 菌株CSN-13產(chǎn)多酚氧化酶培養(yǎng)條件優(yōu)化38-56
• 3.1 前言38
• 3.2 材料38-39
• 3.2.1 菌種38
• 3.2.2 主要試劑38
• 3.2.3 主要儀器設(shè)備38
• 3.2.4 培養(yǎng)基及試劑的配制38-39
• 3.3 方法39-40
• 3.3.1 菌種活化39
• 3.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化39
• 3.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化39-40
• 3.3.4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化40
• 3.4 結(jié)果與分析40-53
• 3.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化40-43
• 3.4.1.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響40
• 3.4.1.2 麩皮濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響40-41
• 3.4.1.4 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響41
• 3.4.1.5 硝酸銨濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響41-42
• 3.4.1.6 茶水對(duì)產(chǎn)酶的影響42
• 3.4.1.7 茶水濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響42-43
• 3.4.2 發(fā)酵條件優(yōu)化43-45
• 3.4.2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株CSN-13產(chǎn)多酚氧化酶的影響43
• 3.4.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響43-44
• 3.4.2.3 初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響44
• 3.4.2.4 轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響44-45
• 3.4.2.5 培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化后菌株CSN-13產(chǎn)多酚氧化酶的動(dòng)態(tài)變化45
• 3.4.3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化45-53
• 3.4.3.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)法篩選影響液體發(fā)酵產(chǎn)多酚氧化酶的顯著因子45-47
• 3.4.3.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)47-48
• 3.4.3.3 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果48-53
• 3.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化法最優(yōu)配方的驗(yàn)證53
• 3.5 小結(jié)與討論53-56
• 第四章 多酚氧化酶的分離、純化和酶學(xué)性質(zhì)研究56-70
• 4.1 前言56
• 4.2 材料56-58
• 4.2.1 菌種56
• 4.2.2 主要藥品及設(shè)備56-57
• 4.2.3 主要試劑的配制57-58
• 4.3 方法58-61
• 4.3.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定58-59
• 4.3.2 多酚氧化酶酶活測(cè)定59
• 4.3.3 多酚氧化酶的分離純化59-60
• 4.3.3.1 粗酶液的提取59
• 4.3.3.2 硫酸銨分級(jí)沉淀59-60
• 4.3.3.3 DEAE-纖維素陰離子交換柱層析60
• 4.3.3.4 葡聚糖G-150凝膠柱層析60
• 4.3.3.5 SDS-PAGE凝膠電泳60
• 4.3.4 多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)的研究60-61
• 4.3.4.1 反應(yīng)進(jìn)程曲線60-61
• 4.3.4.2 最適pH值61
• 4.3.4.3 最適溫度61
• 4.3.4.4 最適底物濃度61
• 4.3.4.5 金屬離子對(duì)多酚氧化酶的影響61
• 4.4 結(jié)果與分析61-67
• 4.4.1 硫酸銨分級(jí)沉淀的確定61-62
• 4.4.2 DEAE-纖維素陰離子交換層析62
• 4.4.3 葡聚糖G-150凝膠柱層析62-63
• 4.4.4 多酚氧化酶各步純化結(jié)果63-64
• 4.4.5 多酚氧化酶催化反應(yīng)的進(jìn)程曲線64-65
• 4.4.6 多酚氧化酶的最適pH65
• 4.4.7 多酚氧化酶的最適溫度65-66
• 4.4.8 底物濃度對(duì)酶活力的影響66
• 4.4.9 金屬離子對(duì)多酚氧化酶活性的影響66-67
• 4.5 小結(jié)與討論67-70
• 第五章 菌株CSN-13多酚氧化酶對(duì)茶多酚生物轉(zhuǎn)化的初步研究70-82
• 5.1 前言70
• 5.2 材料70-72
• 5.2.1 菌種70
• 5.2.2 主要藥品及設(shè)備70-71
• 5.2.3 培養(yǎng)基及試劑的配制71-72
• 5.3 方法72-73
• 5.3.1 茶多酚對(duì)菌株CSN-13生長(zhǎng)的影響72
• 5.3.2 菌株CSN-13發(fā)酵液對(duì)茶湯的“轉(zhuǎn)化”作用72
• 5.3.3 HPLC分析72-73
• 5.3.4 菌株CSN-13在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)及優(yōu)化73
• 5.4 結(jié)果與分析73-79
• 5.4.1 茶多酚對(duì)菌株CSN-13生長(zhǎng)的影響73
• 5.4.2 菌株CSN-13粗酶液對(duì)茶湯的“轉(zhuǎn)化”作用73-74
• 5.4.3 粗酶液轉(zhuǎn)化茶多酚的HPLC分析74-77
• 5.4.4 菌株CSN-13在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)以及優(yōu)化77-78
• 5.4.5 固體發(fā)酵所產(chǎn)粗酶液對(duì)茶多酚的轉(zhuǎn)化效果78-79
• 5.5 小結(jié)與討論79-82
• 第六章 結(jié)論與展望82-86
• 6.1 結(jié)論82-83
• 6.2 問題及展望83-86
• 參考文獻(xiàn)86-94
• 攻讀學(xué)位期間承擔(dān)的科研任務(wù)與主要成果94-96
• 致謝96-98
• 索引98-100
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷100-104

【參考文獻(xiàn)】

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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本文編號(hào)：697854