本文關鍵詞：尼可霉素生物合成基因簇的改造及其異源表達

  更多相關文章： 圈卷產(chǎn)色鏈霉菌 尼可霉素 異源表達 抗菌活性 產(chǎn)物鑒定

【摘要】：尼可霉素(Nikkomycin)屬于核苷肽類抗生素,由核苷和肽基兩部分通過肽鍵連接而成。尼可霉素在結構上與幾丁質(zhì)合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺類似,是幾丁質(zhì)合成酶的強競爭性抑制劑,可有效地抑制真菌細胞壁的合成,而導致其死亡,是一種具有應用前景的新型農(nóng)用抗生素。本文以含有完整尼可霉素生物合成基因簇的pNIK為出發(fā)質(zhì)粒,通過PCR-targeting方法,將基因簇中sanG和sanF的啟動子替換為組成型強啟動子hrdB,目的是構建重組質(zhì)粒pNIKm;通過鏈霉菌-大腸桿菌間接合轉移的方法將pNIK和pNIKm分別導入天藍色鏈霉菌M1146 (Streptomyces coelicolor M1146)中；并通過RT-PCR的方法檢測基因簇的表達情況；最后通過抗菌活性實驗和產(chǎn)物的分離鑒定,觀察尼可霉素的抗菌活性及產(chǎn)生情況。本論文的主要研究成果如下：(1)成功地構建了重組載體pNIKm,并使尼可霉素基因簇在異源宿主天藍色鏈霉菌M1146中得到了成功的表達,得到了兩個異源表達菌株M1146-NIK和M1146-NIKm;(2) M1146-NIK和M1146-NIKm均對長柄鏈格孢有明顯的抗菌活性；(3) M1146-NIK和M1146-NIKm均能產(chǎn)生少量的尼可霉素X和Z,以及假尼可霉素Z；(4) M1146-NIK和M1146-NIKm還產(chǎn)生了大量的中間體,M1146-NIK大量積累了核苷,而M1146-NIKm大量積累了尿苷、核糖基-4-甲酰-4-咪唑-2-酮和吡啶同型蘇氨酸。將尼可霉素生物合成基因簇導入異源宿主并成功表達,分離鑒定了尼可霉素的產(chǎn)物及其生物合成中間體,為尼可霉素核苷和肽基縮合的酶學機制的研究以及尼可霉素與其它核苷肽類抗生素的組合生物合成的研究提供理論依據(jù)和指導。
【關鍵詞】：圈卷產(chǎn)色鏈霉菌 尼可霉素 異源表達 抗菌活性 產(chǎn)物鑒定
【學位授予單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TQ465;Q78
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• Abbreviations8-9
• Gene Symbol9
• Amino Add Abbreviation9-10
• 1 前言10-23
• 1.1 鏈霉菌概述10-12
• 1.1.1 鏈霉菌的基本特征10-11
• 1.1.2 鏈霉菌的基因組特征11-12
• 1.2 核苷肽類抗生素概述12-14
• 1.3 尼可霉素的生物合成及其分子調(diào)控14-20
• 1.3.1 尼可霉素的生物合成15-17
• 1.3.2 尼可霉素的生物合成調(diào)控17-19
• 1.3.3 尼可霉素與其他核苷肽類抗生素的組合生物合成研究19-20
• 1.4 異源表達20-22
• 1.5 本論文的研究內(nèi)容及意義22-23
• 2 材料與方法23-39
• 2.1 實驗材料23-30
• 2.1.1 菌株、質(zhì)粒及引物23-25
• 2.1.2 酶及常用試劑25-26
• 2.1.3 主要儀器和設備26-27
• 2.1.4 培養(yǎng)基27-28
• 2.1.5 緩沖液28-30
• 2.1.6 各種抗生素的貯存濃度和使用濃度30
• 2.2 方法30-39
• 2.2.1 大腸桿菌及鏈霉菌質(zhì)粒的小量提取30-31
• 2.2.2 鏈霉菌總DNA的少量制備及PCR擴增條件31-32
• 2.2.3 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化32-33
• 2.2.4 PCR targeting33-34
• 2.2.5 鏈霉菌大腸桿菌之間的接合轉移34
• 2.2.6 鏈霉菌RNA的提取及RT-PCR34-37
• 2.2.7 發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性檢測37
• 2.2.8 發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析37-38
• 2.2.9 發(fā)酵產(chǎn)物的分離、純化38-39
• 3 結果與討論39-59
• 3.1 重組質(zhì)粒pNIKm的構建及酶切驗證39-43
• 3.1.1 重組質(zhì)粒pBS-HIhF的構建39
• 3.1.2 重組質(zhì)粒pSET152-hGX的構建39-41
• 3.1.3 重組質(zhì)粒pNIKm的構建及酶切驗證41-43
• 3.2 異源表達菌株M1146-NIK和M1146-NIKm的構建及PCR驗證43-44
• 3.3 尼可霉素的異源表達對基因簇內(nèi)關鍵基因的轉錄影響44-47
• 3.3.1 RNA質(zhì)量檢測44-46
• 3.3.2 基因簇內(nèi)關鍵基因的轉錄情況46-47
• 3.4 發(fā)酵產(chǎn)物的抗真菌活性檢測47-48
• 3.5 發(fā)酵產(chǎn)物的巴比妥酸顯色反應的檢測48-49
• 3.6 發(fā)酵產(chǎn)物的分離和純化49-54
• 3.7 發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定54-59
• 4 結論59-60
• 5 展望60-61
• 6 參考文獻61-70
• 7 攻讀碩士期間發(fā)表論文情況70-71
• 8 致謝71-72

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